A-Kinase anchoring protein GSKIP regulates tumorigenic pathways in lung cancer cells

Abstract

The onset of EMT is one of the hallmarks of tumorigenesis, which involves a complex cascade of multiple intracellular signaling pathways and extracellular cross talk, its activation in cancer cells signifies a first step in generation of usually fatal distant metastasis. Therefore, elucidating the regulatory elements of EMT signaling is of great therapeutic value. GSK3β is a multifunctional kinase implicated in EMT regulation as well as other tumorigenic signaling pathways, such as Wnt signaling and glycogen metabolism. One of the regulatory proteins of GSK3β is PKA, a kinase activated by cAMP. Deregulation of cAMP/PKA signaling pathway is implicated in tumorigenic metabolic reprogramming and EMT. PKA can inhibit GSK3β by direct phosphorylation and this phosphorylation is facilitated by the AKAP GSKIP via direct binding to PKA and GSK3β. Since GSKIP is able to regulate GSK3β activity via PKA as well as PKA activity spatially and temporally, elucidating GSKIP’s exact function in tumorigenesis is compelling. The principle cell model for studying GSKIP’s function in this work was A549 lung carcinoma cells. GSKIP Kd in A549 cells significantly inhibits cell migration without affecting cell viability. In addition, GSKIP Kd results in a significant increase in the protein expression levels of E-cadherin and a significant decrease in protein expression levels of its transcriptional repressors, ZEB1and SNAIL. A significant reduction in potent EMT inducers, such as TGFβ and GPI/AMF and actin cytoskeleton regulator CD44, was also observed upon GSKIP Kd. This modulation explains the reduced migration and indicates a role of GSKIP in EMT regulation. In addition to its regulation of EMT, GPI/AMF regulates metabolism and together with GSK3β’s and PKA’s intricate roles in metabolic pathways, GSKIP’s role in metabolism was evaluated. The results show that upon GSKIP Kd cells downregulate their dependence on mitochondrial energy production via OXPHOS. This downregulation was attributed to reduced TCA cycle flux due to reduced PDH activity. These results indicate that upon GSKIP Kd A549 cells switch from catabolic metabolism, characterizing invasive cells, to anabolic metabolism. In summary, the current research demonstrates for the first time GSKIP’s involvement in EMT and metabolism regulation in cancer cells, thus implicating GSKIP as a potential coupling agent between metabolic reprograming of cancer cells and EMT, and proposes GSKIP as a potential therapeutic target.

Die Epitheliale Mesenchymale Transition (EMT) kennzeichnet die Tumorgenese und gilt als erster Schritt der Metastasenbildung. Die Transition der Krebszellen wird durch verschiedene intrazelluläre Signalwege gesteuert. Die Beschreibung elementarer regulatorischer Komponenten dieser Signalwege hat somit einen großen therapeutischen Wert. GSK3ß ist eine multifunktionale Kinase, die neben EMT auch andere tumorinduzierende Signalwege reguliert; z.B. den Wnt-Signalweg und den Glycogenmetabolismus. GSK3β wird durch PKA, einer durch cAMP aktivierten Proteinkinase, phosphoryliert. Eine Dysregulation des cAMP/PKA Signalwegs führt während der Tumorgenese zu einer metabolischen Umprogrammierung und EMT. Die Phosphorylierung von GSK3β durch PKA wird durch die Assoziation des AKAPs GSKIP erleichtert, ein Gerüstprotein das sowohl PKA als auch GSK3β bindet. Neben der Phosphorylierung von GSK3β reguliert GSKIP auch die räumliche und zeitliche Organisation von PKA, was die Rolle von GSKIP in der Tumorgenese in den Fokus rückt / interessant macht. Als zugrunde liegendes Zellmodell zur Analyse der GSKIP-Funktion wurde die Zelllinie A549, gewonnen aus einem Lungenkarzinom, verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass ein GSKIP Kd / eine Reduktion der GSKIP-Expression die Zellmigration signifikant inhibiert ohne dabei die Zellviabilität zu beeinflussen. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass der GSKIP Kd eine signifikant erhöhte Expressionsrate von E-cadherin und eine signifikant reduzierte Expressionsrate von ZEB1 und SNAIL, zwei Transkriptions-Repressoren, bewirkt. Die signifikante Reduktion von EMT induzierenden Faktoren wie TGFβ, GPI/AMF und der Regulator des Aktin-Cytoskeletts CD44 wurde ebenfalls durch die reduzierte GSKIP-Expression hervorgerufen und erklärt die reduzierte Migrationsrate. Dies weist eine mögliche relevante Rolle von GSKIP in der Regulation von EMT auf. GPI/AMF reguliert neben EMT auch den Metabolismus und zusammen mit der Rolle von GSK3β und PKA in metabolischen Signalwegen wurde die Rolle von GSKIP experimentell untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die reduzierte GSKIP-Expression in der Zelle die mitochondriale Energieproduktion über OXPHOS reduziert. Dem liegt ein reduzierter Zitronensäurezyklus durch verminderte PDH Aktivität zugrunde. Es lässt sich folgern, dass eine reduzierte GSKIP-Expression in A549 Zellen zu einem Wechsel vom katabolischen Metabolismus zum anabolischen Metabolismus führt, ein Kennzeichen von invasiven Zellen.