Transiente Öffnung der Blut-Hirnschranke für kleine Moleküle durch Claudin-5-Modulatoren

Abstract

Die Therapie vieler ZNS-Erkrankungen wird durch die schlechte Zugänglichkeit des Gehirngewebes für die meisten Wirkstoffe stark eingeschränkt. Verantwortlich dafür ist die Blut-Hirnschranke (BHS), die durch Endothelzellen der Gehirnkapillaren gebildet wird und die Transportwege streng reguliert, sodass nur ausgewählte Substanzen aus dem Blut in das ZNS gelangen. Andere Substanzen, darunter die meisten Pharmaka, können die BHS nur stark eingeschränkt passieren. Die freie Diffusion durch den parazellulären Spalt wird durch die TJ, einem Multiproteinkomplex, blockiert. Rückgrat dieser TJ sind Cld, wobei Cld5 dominiert. Dieses Protein interagiert mit Cld benachbarter Zellen ( trans- Interaktion) und dichtet den parazellulären Spalt für Moleküle <800 Da ab. Dieser Größenbereich entspricht den meisten Pharmaka. Hypothese dieser Arbeit ist daher, dass die kurzzeitige Aufhebung der trans- Interaktion von Cld5 zu einer gesteigerten sowie größenspezifischen und transienten Durchlässigkeit der BHS für Wirkstoffe führt. Dazu wurden Effektoren, welche die Dichtigkeit der BHS manipulieren, gesucht und charakterisiert. So wurde die barriere-öffnende Wirkung von Caprat auf die TJ detailliert untersucht, um dessen Eignung als BHS-Modulator zu prüfen. Für die Auffindung neuer Modulatoren wurde ein Hochdurchsatz-Screening (HDS) etabliert und durchgeführt. Die Versuche wurden initial an TJ-freien HEK-293 Zellen, die stabil mit Cld5-YFP transfiziert waren, durchgeführt. Die Modifikation der Cld5 trans-Interaktion konnte somit frei von Interferenzen anderer TJ-Proteine in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie analysiert werden. Für die Wirkung im Kontext funktioneller TJs wurden epitheliale Barriere-Modelle, wie MDCK-II oder Caco-2 Zellen, verwendet, welche entweder stabil mit Cld5 transfiziert waren bzw. endogen Cld5 exprimieren. Um eine Wirkung der Substanzen auf die BHS zu untersuchen, wurden die endotheliale BHS-Modelle bEnd5-Zellen, primäre Gehirn-Kapillar-Endothelzellen und isolierte Kapillaren aus dem Gehirn der Maus verwendet. Die Untersuchungen ergaben, dass die bisher bestehende Vorstellung zum Wirkmechanismus von Caprat erweitert werden muss. Es konnte gezeigt werden, dass Caprat die trans-Interaktion von Cld5 und dessen subzelluläre Lokalisation, sowie den Gehalt von F-Aktin über einen unabhängigen Wirkmechanismus in MDCK-II-Cld5 und bEnd5 Zellen reduzierte. Die Wirkung auf Cld5 war reversibel sowie zeit- und konzentrationsabhängig. Das Gerüstprotein ZO-1, welches Cld5 mit dem Aktin-Zytoskelett verbindet, verblieb in den epi- und endothelialen Zellen an den Zell-Zellkontakten. Die parazelluläre Permeabilität eines Modellmoleküls (Lucifer Yellow, 457 Da) war in MDCK-II-Cld5 Zellen nach der Inkubation mit Caprat erhöht. Somit wirkte Caprat in einem Konzentrationsbereich von 5-10 mM direkt auf Cld5 und führte so zu einer erhöhten Permeabilität gegenüber kleinen Molekülen. Interessanterweise wirkte Caprat der Kontraktion des apikalen Aktinrings nach extrazellulären Kalzium- und Magnesiumentzug entgegen. Somit schien Caprat unter bestimmten Bedingungen auch eine protektive Wirkung auf Barrieren auszuüben. Mittels HDS konnte eine weitere Substanz (BO1) identifiziert werden, welche die trans-Interaktion von Cld5 in allen untersuchten Zelllinien hemmte. Die Substanz wirkte im µM Konzentrationsbereich nach 3-17 h. Sie verringerte den TER und erhöhte die Permeabilität von LY. Diese Effekte waren konzentrations- und zeitabhängig, sowie spezifisch für Cld5 exprimierende Zellen. Zytotoxische Effekte konnten nicht beobachtet werden, vielmehr war die Wirkung reversibel. Aufgrund der Untersuchungen mittels konfokaler Mikroskopie wurde eine Internalisierung von Cld5 nach Inkubation angenommen. Zusammenfassend sind sowohl Caprat als auch BO1 geeignete Kandidaten für die Manipulation von Cld5 und folglich der BHS in vivo. Zu diesem Zweck wurden Versuche aufgenommen, um die Wirkung von Caprat und BO1 auf die BHS tierexperiementell zu prüfen.

The effective therapy and treatment of many cerebral diseases is often hindered by the blood-brain barrier (BBB) which is formed by cerebral capillar endothelial cells and is essential for the homeostasis of the central nervous system. Both the transcellular transport as well as the paracellular permeability are controlled by the BBB so that only very few substances are taken up. Most pharmaceuticals can only pass through the BBB in limited amounts. The free diffusion through the paracellular space is regulated through a multi-protein complex, the TJ. The backbone of the TJ are Clds, whereby Cld5 is dominating. This specific protein interacts with other Cld molecules expressed in neighboring cells (trans-interaction) and closes the paracellular space for molecules <800 Da. This is the range of the majority of pharmaceuticals. The hypothesis of this work is to explore the possibility of short-term suspension of the trans-interaction of Cld5 and therefore of a larger, size-specific and transient permeability of the BBB for pharmaceutics. Therefore various molecules which affect the permeability of the BBB were investigated and characterized. Known molecules like caprate were explored to open cellular barriers via the TJ and its suitability as a BBB modulator. For the discovery of new modulators, a HTS (high throughput screening) was established and implemented. In order to investigate the modification of Cld5 trans-interactions without the interference of other TJ-proteins in living cells the TJ-free HEK-293 cells stably expressing Cld5-YFP were analyzed confocal microscopically. For the effectiveness of the investigated molecules in the context of TJs, cell barrier models, such as Caco-2 and MDCK-II, were used expressing endogenous Cld5 and stably transfected with Cld5, respectively. In order to explore the effectiveness of a substance on the BBB, endothelial BBB models, bEnd5, primary brain capillary endothelial cells and isolated capillary from mice brains were used. The results showed that the previously proposed mode of action of caprate is not applicable to all cell lines overall. It was now shown that caprate reduced the trans-interaction of Cld5 and the junctional localization, as well as the concentration of F-actin via an independent mode of action in MDCK-II-Cld5 and bEnd5 cells. The effect on Cld5 was time- and concentration-dependent, and fully reversible. The scaffold protein ZO-1, which connects Cld5 with the actin cytoskeleton, remained at the cell junctions in the epithelial and endothelial cells. However, caprate increased the permeability of lucifer yellow (LY, 457 Da) in MDCK-II-Cld5 cells. Consequently, as a result of the effect on Cld5 trans- interaction and actin cytoskeleton, caprate led to an increase of permeability with respect to small molecules, in a concentration range of 5-10 mM. Interestingly, caprate counteracted the contraction of apical actin-rings after extra-cellular extraction of calcium and magnesium. Thus, caprate also appears to have a protective function on barriers under certain circumstances. A further substance (BO1) was identified which inhibited the trans-interaction of Cld5 in all cell lines investigated. The substance was active in µM concentration after 3-15 h. It lowered the trans-epithelial resistance and increased the permeability of LY. These effects were concentration and time dependent as well as Cld5 specific. No cytotoxic effects was observed and the effect was reversible. Based on the results, internalization of Cld5 after incubation has been assumed. It can be concluded that caprate, as well as BO1, are both promising candidates for the manipulation of Cld5 and, as a result, the BBB in vivo. For this purpose, further studies on the effectiveness of caprate and BO1 on animals have been initiated.