Molecular and Functional Characterization of the Galectin-3-Binding Protein LGALS3BP in Cancer and Centrosome Biology

Abstract

The centrosome acts as the main microtubule-organizing centre in eukaryotic cells. Besides its function in microtubule nucleation it is further implicated in integrating cellular signalling pathways that are essential for cell cycle progression or the response to DNA damage, for instance. In cancer, numerical and structural centrosome aberrations are frequently detected where they contribute to chromosomal instability. Seeking for factors that are functionally relevant for these centrosomal abnormalities, our group established a protein-protein interaction network among centrosomal and cell cycle-regulatory proteins using TAP-MS analysis. Thereby, LGALS3BP, which is deregulated in cancer, was revealed to interact with centrosomal components. The subcellular localization of LGALS3BP to centrosomes and in particular to the proximal part of centrioles was validated by several approaches in this study. LGALS3BP has been previously reported as a secreted glycoprotein with extracellular functions. The present study, however, provides striking evidence that LGALS3BP is involved in the maintenance of centrosome integrity: LGALS3BP upregulation caused centrosome hypertrophy, while depletion led to an accumulation of defective centriolar structures. Supportingly, LGALS3BP deregulation correlated with centrosome abnormalities in certain prostate as well as breast cancer cell lines. Importantly, two rescue experiments revealed a reversion of these phenotypes towards control cells upon restoration of normal LGALS3BP levels. Furthermore, the presence of both LGALS3BP and its interaction partner C-Nap1 was found to be crucial for cell proliferation and viability as simultaneous loss of these proteins caused aneuploidy and apoptosis. An in vitro kinase assay on LGALS3BP peptides revealed AKT1, CHK1 and CHK2 as candidate kinases, which suggests an implication of LGALS3BP in AKT signalling downstream events and DNA damage response. Together, these findings asked for mechanisms that regulate LGALS3BP expression and reasons for its deregulation in cancer. The present study revealed BRD4 as a positive regulator of LGALS3BP gene expression and as a mediator of INFγ-induced LGALS3BP upregulation. Additionally, EZH2 was found responsible for silencing LGALS3BP gene expression in prostate cancer as EZH2 depletion in a respective prostate cancer cell line led to re-expression of LGALS3BP. BRD4 and EZH2 are deregulated in various cancer types, which might explain LGALS3BP deregulation and centrosome aberrations. This study represents the first characterization of intracellular LGALS3BP maintaining centrosome integrity and function. The new insights into LGALS3BP transcriptional regulation now provide opportunities to study if epigenetic therapies targeting LGALS3BP could counteract centrosome aberration in cancer.

Das Zentrosom stellt das wesentliche Mikrotubuli-organisierende Zentrum in eukaryotischen Zellen dar. Neben seiner Funktion bei der Mikrotubulinukleation ist es beteiligt an der Integration von zellulären Signaltransduktionswegen, welche beispielsweise für das Fortschreiten des Zellzyklus sowie für die Antwort auf DNS-Schäden wichtig sind. Numerische und strukturelle Aberrationen des Zentrosoms treten sehr häufig während der Krebsentstehung auf und tragen zur Ausbildung von chromosomaler Instabilität bei. Um funktionell relevante Faktoren für diese zentrosomalen Anomalien zu identifizieren, wurde von unserer Arbeitsgruppe ein Proteininteraktionsnetzwerk mittels TAP-MS-Analyse etabliert, welches sich um zentrosomale und Zellzyklus-regulierende Proteine aufbaut. Hierbei wurde LGALS3BP, ein in Krebs dereguliertes Protein, entdeckt, welches mit anderen zentrosomalen Proteinen interagierte. Es konnte durch mehrere Methoden gezeigt werden, dass LGALS3BP am Zentrosom lokalisiert und zwar insbesondere am proximalen Teil der Zentriolen. Zuvor wurde LGALS3BP als ein sekretiertes Glykoprotein mit extrazellulären Funktionen beschrieben. Diese Studie jedoch belegt, dass LGALS3BP auch an der Aufrechterhaltung zentrosomaler Integrität beteiligt ist. Eine Hochregulation von LGALS3BP führte zu zentrosomaler Hypertrophie, wohingegen eine Verminderung von LGALS3BP eine Akkumulation fehlerhafter zentriolärer Strukturen bewirkte. Diese Ergebnisse korrelieren positiv mit LGALS3BP-Fehlexpression und zentrosomalen Aberrationen in verschiedenen Prostata- und Brustkrebszelllinien. Zudem konnte durch die Wiederherstellung normaler LGALS3BP-Expression in zwei Experimenten der jeweilige zentrosomale Phänotyp rückgängig gemacht werden. Es wurde außerdem gezeigt, dass LGALS3BP zusammen mit seinem Interaktionspartner C-Nap1 für die Zellproliferation und -lebensfähigkeit benötigt wird, da das Herunterregulieren beider Proteine zu Aneuploidie und Apoptose führte. Des Weiteren wurden die Kinasen AKT1, CHK1 und CHK2 über eine in vitro Phosphorylierungs-Analyse an LGALS3BP-Peptiden identifiziert, was darauf hindeutet, dass LGALS3BP in AKT-Signalwegen und in Antwortmechanismen auf DNS-Schäden involviert sein könnte. Aufgrund dieser Ergebnisse stellte sich die Frage nach Möglichkeiten der transkriptionellen Regulation von LGALS3BP und nach den Ursachen dessen Deregulierung in Krebs. In dieser Studie VIIZusammenfassung wurde BRD4 als ein positiver Regulator der LGALS3BP-Genexpression ermittelt, welcher auch als Mediator der INFγ-Antwort von LGALS3BP agierte. Zudem wurde EZH2 für die LGALS3BP-Genstilllegung in Prostatakrebs verantwortlich gefunden, da eine Verminderung von EZH2 zur Reexpression von LGALS3BP in einer entsprechenden Prostatakrebszelllinie führte. In verschiedenen Krebsarten werden BRD4 und EZH2 häufig fehlexprimiert, was auch die LGALS3BP-Deregulation und somit die zentrosomalen Anomalien erklären könnte. Die vorliegende Arbeit stellt die erste Charakterisierung von intrazellulärem LGALS3BP dar, welches zentrosomale Integrität und Funktion aufrechterhält. Die neuen Einblicke in die transkriptionelle Regulation von LGALS3BP erlauben es nun experimentell zu ergründen, ob auf LGALS3BP gerichtete epigenetische Therapien Auswirkungen auf die Krebsentwicklung haben und die möglicherweise ursächlichen zentrosomalen Anomalitäten reduzieren.