Zellbasierte Testverfahren zur Untersuchung von NMDA-Rezeptor-Antikörpern

Abstract

Die Anti-N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDAR)-Encephalitis wurde 2007 erstmals beschrieben und ist eine der häufigsten Ursachen für eine Encephalitis. Im Unterschied zu anderen Formen autoimmuner Encephalitiden folgt die Anti-NMDAR- Encephalitis häufig einem rasanten und schweren Verlauf einhergehend mit Bewusstseinseintrübung, epileptischen Anfällen, autonomer Dysregulation und Hypopnoe bis hin zu Intensivpflichtigkeit mit teils tödlichem Ausgang. Die Diagnostik erfolgt bei typischer Klinik durch den spezifischen Nachweis der pathogenen Antikörper aus Liquor oder Serum gegen den NMDA-Rezeptor. Eine Vorhersage der Krankheitsschwere ist derzeit nicht möglich, wäre aber für die frühzeitige und angemessene Behandlung sehr hilfreich. Eine denkbare Rolle für die Prognose könnte die Affinität der NMDAR-Antikörper spielen. Daher entwickelten wir zellbasierte Testverfahren, mit denen sich geringe Antikörpertiter mit hoher Sensitivität nachweisen lassen und ein Vergleich der Bindungsaffinitäten von NMDAR-Antikörpern unterschiedlicher Patienten in Folgeuntersuchungen möglich ist. Zu diesem Zweck wurde die cDNA der NR1-Untereinheit des humanen NMDA-Rezeptors mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, in verschiedene Vektoren kloniert und aus Escheria coli aufgereinigt. Im Folgenden wurden transient transfizierte, und stabile NMDAR- exprimierende HEK-Zelllinien entwickelt. Hiermit konnten in der indirekten Immunfluoreszenzfärbung humane NMDAR-Antikörper aus Liquor und Serum von Patienten in deutlich niedrigerer Konzentration als mit kommerziell verfügbaren Assays nachgewiesen werden. Eine Verwendung der transfizierten HEK-Zellen in der Durchflusszytometrie ermöglichte eine exakte Quantifizierung der Antikörpertiter, welches zur Prüfung des Behandlungserfolges genutzt werden könnte und somit zur Verlaufskontrolle geeignet wäre. Weiterhin koppelten wir Liquorantikörper von Patienten mit dem Fluorochrom Alexa 594. Dies ermöglichte humane NMDAR-Antikörper auch ohne Zweitantikörper nachzuweisen. Weiterhin konnten mit diesem Verfahren erstmals nicht-humane NMDAR-Liquorantikörper detektiert werden. Die post mortem Liquoranalyse eines jungen Eisbären (Ursus maritimus) erbrachte den Nachweis von hochtitrigen Antikörpern gegen die NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors. Diese Antikörper zeigten in der Immunhistochemie ein typisches neuropiles Verteilungsmuster in Hippocampus und Kleinhirn, wie es bei menschlichen Patienten mit Anti-NMDAR- Encephalitis typisch ist. In Übereinstimmung mit der Klinik, insbesondere epileptischen Anfällen, und dem histopathologischen Nachweis einer floriden Encephalitis mit Plasmazellinfiltration lässt dies darauf schließen, dass dieser Eisbär an einer Anti-NMDAR-Encephalitis gestorben ist. Dies ist weltweit der erste dokumentierte nicht-menschliche Fall und legt nahe, dass auch andere Säugetiere von dieser behandelbaren Erkrankung betroffen sein könnten. Autoimmunität gegen neuropile Strukturen könnte somit ein neuer spezies-übergreifender und damit grundlegender Pathomechanismus bei Säugetieren sein.

Discovered in 2007, anti-N-Methyl-D-Aspartat receptor (NMDAR) encephalitis is one of the most commonly identified causes for encephalitis. The disease often runs a severe and rapid course showing reduced state of consciousness, epileptic seizures, autonomic dysregulation and hypopnea leading to intensive care unit treatment and even death. Clinical diagnosis is made by detection of pathogenic NMDAR antibodies from a patient’s cerebrospinal fluid (CSF) or serum. Little is known about prognosis factors for the disease severity, but would be helpful for providing early and appropriate treatment. We suppose the affinity of NMDAR antibodies might be an important predicting factor. We developed highly sensitive methods to detect low concentrations of NMDAR antibodies, which can be used to analyze antibody affinity of different patients in future. Therefore, cDNA of the NR1 subunit of the NMDA receptors was amplified by polymerase chain reaction, cloned into different vectors and purified from Escheria coli for transient and stable transfection. Immunofluorescence staining on transfected HEK-cells detected lower concentrations of human NMDAR antibodies than commercial assays and flow cytometry showed exact quantification of the antibody titer, which can be used to monitor clinical progress and evaluate therapeutic success in follow-up examinations. Further CSF was conjugated with Alexa Fluor 594 to detect human and non-human NMDA receptor antibodies without secondary antibodies. The post mortem CSF analysis of a young polar bear (Ursus maritimus) suffering epileptic seizures showed strong binding to HEK cells expressing NMDA receptors. Tissue immunohistochemistry exploration demonstrated a typical neuropil signal in hippocampus and cerebellum as in human patients with NMDAR encephalitis and histopathological examination showed an encephalitis with infiltration of plasma cells. We conclude, death was caused by NMDAR encephalitis. This is the first reported non-human case and suggests, that other mammals might suffer from this treatable disease. Autoimmune response against neuropil structures might be a basic pathomechanism across mammal species.