Refinement strategies in breeding and keeping of laboratory mice

Abstract

Refinement strategies in breeding and keeping of laboratory mice play a pivotal role in assuring the best possible solution as long as animal based research is indispensable. Furthermore, Refinement is one of the three Rs proclaimed by Russel and Burch in 1959 that found their way into the current European legislative on the protection of animals used for scientific purposes. In Germany a majority of 72,83 percent of all vertebrates used in experiments are mice, totaling over two million individuals. Almost all used laboratory mice are descendants of the house mouse (Mus musculus). The domestication of mice started at the beginning of the 17th century, when mice were kept and bred for different intentions and led to its proceeding domestication. In Great Britain mice were already in the focus as objects of study, but they were as well popular within amateur breeders that created the so-called “fancy mice”. Subsequent and more and more professional breeding led to the emerging of the first inbred mouse strains in 1909. This launched a cascade that enables researchers today to draw on a reservoir of over 450 inbred strains of mice. The necessity of mouse models becomes visible when keeping in mind that almost 90% of the 106 Nobel Prizes awarded for Physiology or Medicine included research relying on them. To understand the basic needs of laboratory mice it is essential to have a closer look at their ancestors. They are still living among us as wild mice with either a feral, non-commensal way of life or they live as commensals associated with humans. The domestication did not change much in the behavior of mice as they still are nocturnal animals with a strong basic need for living in a group. But some of the basic changes coming along with domestication are applicable for laboratory mice as well, as they are usually less aggressive and more easily to tame than their wild relatives. The experimental aspect of the thesis consists of two parts that both contribute to gain knowledge about minimizing the lifelong experience of pain, suffering, distress or long-lasting harm for laboratory mice. The first part aims to refine the breeding methods and the second part is a new approach to create a mouse-human relationship as well as to add a new form of enrichment - cognitive enrichment. The evaluation of different breeding conditions is consistent with data found in literature that in not profitable conditions postnatal litter loss reaches numbers up to 50 percent. In detail, the present study evaluated the impact of an impoverished, a super-enriched and a standard-enriched condition from the prenatal period until weaning of the offspring. A solid and constant breeding success was discovered in the standard enriched cage. The superenriched condition did provide more unpalatable results concerning litter loss and pup growth. The most prominent finding was the detrimental high litter losses and the delayed pup development in the impoverished condition. The result that the highest prevalence of pup mortality occurred during the first four days after birth, leads to the conclusion, that if the usually counting of pups at weaning is going on, a huge amount of infant death is not recorded. To get a hint of how much influence the prenatal condition has on the maternal quality and thus on the offspring’s development, we tested a group with a change of the condition from impoverished and super-enriched to standard enrichment on P1. The swapping did not result in a prevention of perinatal litter loss. But one can estimate, that there was a certain effect of the variation in enrichment as the neonatal weight gap between the groups was closed until weaning. But not just a tribute to Refinement is approached but due to a better knowledge of the prevention of litter loss, a reduction of the animal number can be realized. We successfully overcame the challenge to create a positively connoted mouse-human relationship and to introduce a PRT into the keeping of laboratory mice. Previous research provided the information that gentle handling protocols contribute to more relaxed mice. Enrichment is one major factor enabling mice to interact with their surroundings, and by manipulating things, they gain control over their environment. Control and the possibility to predict what is likely to happen next have a deep impact on the stress level. This study concentrated on clicker-training with one intention of an escalated handling protocol and with another intention of providing a new form of enrichment- cognitive enrichment. In clickertraining positive reinforcement consists of a chain of two reinforcers. The primary reinforcer is the food reward and a second reinforcer- a click is added to build up a time bridge between the strengthened behavior and an upcoming reward. Our little fellow creatures differ in their personality, even though they have an equal genetic background and born and raised under the same conditions. The food reward must address the motivation of each mouse, because motivation is the underlying reason why mice are participating in training. Further the cognitive abilities of mice turned out to be more than enough to perform the assigned tasks. The clicker-training of mice turned out to be quite simple. The evaluation of different behavioral experiments stress that trained mice are more confident in the interaction with humans and show less stress related and less depression like behaviors. In addition, stress reduction leads to a lower variability among experimental mice which results in a reduction of the amount of needed subjects and leads to data with a higher quality. This study proposes that clicker-training improves Refinement as well as reduction and thereby contributes in the implementation of the 3R-principle of Russel and Burch.

Solange Tierversuche noch unersetzbar bleiben, ist die Weiterentwicklung von Refinementstrategien essentiell für das Wohlbefinden der Versuchstiere. Bereits 1959 publizierten Russel und Burch die Bedeutung des 3R-Prinzips „Replacement“, „Reduction“ und „Refinement“, das sich seit wenigen Jahren seinen Weg in die europäische Legislative in die „Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere“ gebahnt hat. Die intensive Auseinandersetzung mit der Haltung von Labormäusen ist ein entscheidender Faktor, da fast drei Viertel aller Versuchstiere Mäuse sind. In Zahlen bedeutet das, dass allein in Deutschland pro Jahr mehr als zwei Millionen Mäuse zu Versuchszwecken gehalten werden. Um die Bedürfnisse dieser kleinen Nager zu verstehen, muss man sich ihre Abstammung und die Lebensweise ihrer Vorfahren ansehen. Bis auf einige Ausnahmen stammen alle Labormäuse von der Hausmaus (Mus musculus) ab. Hausmäuse leben immer noch wie zur Zeit der Domestikation der Labormaus im 17. Jahrhundert entweder angeschlossen an den Menschen als Kommensalen oder sie bestreiten eine vom Menschen völlig unabhängige Lebensweise. Und auch Labormäuse haben sich nur wenig verändert. Sie sind nach wie vor sozial lebende nachtaktive Nagetiere. Allerdings sind auch die gängigen Folgen einer Domestikation an der Maus nicht spurlos vorbeigegangen, so sind sie weniger aggressiv und leichter zu zähmen als ihre wilden Artgenossen. Ein Grund für die Domestikation der Maus war damals bereits ihre hervorragende Eignung als Studienobjekt. Eine weitere Welle der Domestikation steht im Zusammenhang mit Hobbyzuchten, die insbesondere auf Fellfarbe selektierten und somit die „Fancy Mice“ schufen. Seit dem Beginn des 20. Jahrhunderts münden diese beiden Haupteinflüsse in professionelle Zuchten ein und führen schließlich dazu, dass Wissenschaftler heutzutage auf mehr als 450 verschiede Mausestämme zurückgreifen können. Für fast jedes Krankheitsmodell gibt es so die passende Maus. Die große Bedeutung dieser Mausmodelle für die Ergründung bestimmter Fragestellungen wird deutlich, wenn man sich bewusstmacht, dass mit dem Nobelpreis für Physiologie und Medizin ausgezeichnete Werke zu 90% auf der Arbeit mit Mäusen beruhen. Der experimentelle Anteil dieser Arbeit beschäftigt sich zum einen mit der Zucht von Labormäusen während der zweite Teil die Lebensbedingungen in der Haltung von Mäusen untersucht. Beide Teile sind darauf ausgerichtet, Refinementstrategien zu ergründen, die dazu beitragen den Versuchsmäusen ein Leben ohne Schmerzen, Leiden oder Schäden zu ermöglichen. Eine Neonatensterblichkeit von bis zu 50% in der Zucht von Labormäusen erregt Grund zur Besorgnis und macht weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet notwendig. Der Ansatz der ersten Studie war es verschieden angereicherte Zuchtkäfige hinsichtlich Jungtierentwicklung und Jungtiersterblichkeit zu untersuchen. Hierfür wurden drei Grundausstattungen gewählt, eine verarmte, eine superangereicherte und eine Standardeinrichtung, die der Ausstattung nach den FELASA-Richtlinien entspricht. Der Zuchterfolg in den Standard eingerichteten Zuchtkäfigen war konstant gut und übertraf die angegebene Aufzuchtrate des kommerziellen Züchters. Zu unserer Überraschung brachte die Zucht im superangereicherten Käfig deutlich unbeständigere Ergebnisse mit einer reduzierten Wurfgröße. Dies könnte allerdings darauf zurückzuführen sein, dass für das tägliche Zählen der Jungtiere deutlich mehr Käfigeinrichtung entfernt werden musste, was einen negativen Effekt auf den Stresslevel der Mutter gehabt haben könnte. Ein prägnanter Unterschied zeichnete sich in den verarmten Zuchtkäfigen ab, da hier Wurfverluste von 50% und eine verzögerte juvenile Entwicklung zu beobachten war. Ein weiteres alarmierendes Ergebnis ist, dass sich der höchste Jungtierverlust direkt postnatal bis zum vierten Tag nach der Geburt ereignet hat. Da es jedoch gängige Praxis ist, die Jungtiere erst im Alter von drei Wochen bei der Trennung von der Mutter zu zählen wird ein möglicher Jungtierverlust nicht wahrgenommen. Um Auswirkungen der prä- und postpartalen Umwelt auf das Brutpflegeverhalten der Mäuse evaluieren zu können, wurden Tests mit zwei weiteren Gruppen angestellt. Die Mütter saßen präpartal entweder verarmt oder superangereichert und die Käfige beider Gruppen wurden am Tag der Geburt so modifiziert, dass sie der Standardeinrichtung entsprachen. Dies hatte im Vergleich zu den Haltungssystemen ohne Veränderung keinen Einfluss auf die Rate der perinatalen Jungtierverluste. Aber die postpartale Veränderung der Umwelt, hin zur Standardeinrichtung, bewirkte eine Erholung des Wurfes im Hinblick auf die Gewichtszunahme. Nach der Veränderung konnte die Gewichtsdifferenz der Neonaten in den unterschiedlichen Enrichments (Umweltanreicherungen), bis zum Zeitpunkt des Absetzens, in der dritten Lebenswoche, ausgeglichen werden. Weitere Untersuchungen müssen durchgeführt werden um zu untersuchen, ob statt weiteres Enrichment, anderes Enrichment das maternale Verhalten positiv beeinflussen könnte und so zu weniger Jungtierverlusten führen könnte. Eine genaue aber möglichst tierschonende Dokumentation ist essentiell für den Einzug und die Evaluation von Refinement in Zuchten. Aber nicht nur eine Verbesserung der Lebens- bzw. Überlebensbedingungen kann so geschaffen werden, durch höhere Absetzraten kann auch die gesamte Tierzahl reduziert werden, da weniger Zuchtmütter benötigt werden. Der zweite Teil der experimentellen Arbeit befasst sich mit der generellen Realisierbarkeit und den Auswirkungen eines positiven Verstärkungstrainings (PRT) in Labormaushaltungen. Studien belegen bereits, dass intensivierter Kontakt zu den Mäusen dazu beiträgt, dass die Tiere allgemein entspannter sind. Des Weiteren ist Enrichment ein Schlüssel zum Wohlbefinden von Tieren, da es durch Interaktion und eine gewisse Vorhersehbarkeit den Tieren Kontrolle über ihre Umwelt ermöglicht. Zum einen sollte die Etablierung einer Maus-Mensch Beziehung untersucht werden, und zum anderen wollten wir herausfinden, ob Clickertraining ein kognitives Enrichment für Mäuse sein kann. Clickertraining ist ein PRT mit zwei Verstärkern, einem primären, der Futter-Belohnung und einem sekundären, in diesem Fall der Click eines Clickers. Der sekundäre Verstärker dient dazu, die Zeit zwischen korrektem Verhalten und zeitverzögerter Belohnung zu überbrücken. Da sich unsere kleinen Mitgeschöpfe in ihrer Persönlichkeit sehr unterscheiden, obwohl sie fast genetisch identisch und unter den gleichen Bedingungen aufgezogen wurden, war es wichtig herauszufinden, für was sie sich motivieren lassen. Motivation ist der Schlüssel zur Partizipation von Tieren im PRT. Die kognitiven Fähigkeiten der getesteten Mäuse waren mehr als ausreichend, um die entsprechenden Aufgaben zu lernen. Die spätere Auswertung verschiedener Verhaltenstests ergab, dass trainierte Mäuse ruhiger im Umgang mit Menschen sind und auch weniger stressbezogenes und depressionsartiges Verhalten zeigten. Auch hier zeigt sich nicht nur ein Refinementeffekt, sondern wie auch im ersten Teil der Studie spielt das zweite R (Reduction) eine Rolle. Weniger gestresste Tiere führen zu konstanten und valideren Ergebnissen, die eine geringere Streuung aufweisen als die der Kontrollgruppen. Somit führt die Arbeit mit oder an entspannten Tieren zu einer Reduktion der Fallzahl. Schlussfolgernd Schlussfolgernd kann Clickertraining in Mäusehaltungen deutlich zur Umsetzung des 3R-Prinzips beitragen.