Genomweite Expressionsanalyse von Sox17-positiven, endodermalen Vorläuferzellen der Maus

Abstract

Der erste große Schritt in der embryonalen Entwicklung der Vertebraten ist die Bildung der drei Keimblätter - Ektoderm, Mesoderm und Endoderm - während der Gastrulation. Embryonale Zellen des Epiblasten verlieren in diesem Prozess ihre Pluripotenz und schlagen unterschiedliche Entwicklungswege ein, die auf molekularer Ebene nicht vollständig charakterisiert sind. Embryonale Stammzellen (ES Zellen), die aus den pluripotenten Zellen des Epiblasten stammen, exprimieren größtenteils die gleichen Gene wie Epiblastenzellen und können in vitro gezielt in spezialisierte Zelltypen aller drei Keimblätter differenziert werden. Daher geht man davon aus, dass auch zu Beginn der ES Zelldifferenzierung transient Keimblatt-spezifische Gene exprimiert werden. Das während der Gastrulation zwischen Tag 6,0 und 7,5 der Maus- Embryonalentwicklung entstehende endodermale Keimblatt wird auch als definitives Endoderm (DE) bezeichnet. Aus dem DE leiten sich die Organe des gastrointestinalen und respiratorischen Trakts, wie zum Beispiel Leber, Pankreas, Intestinum und Lunge, ab. Neben dem DE entstehen unabhängig von der Gastrulation, zwischen Tag 4,5 bis 5,0 parietales Endoderm (PE) und viscerales Endoderm (VE), die extraembryonales Gewebe bilden. Das direkt dem Epiblasten aufliegende VE spielt zudem eine wichtige Rolle bei der Positionierung der Körperachsen und der Induktion bestimmter embryonaler Strukturen, wie zum Beispiel der Kopffalte. Obwohl sich VE und DE in der Embryonalentwicklung völlig unterschiedlich ableiten lassen, besitzen sie dennoch gemeinsame funktionelle und molekulare Eigenschaften. Beide Endodermderivate exprimieren den Transkriptionsfaktor Sox17, der eine zentrale Rolle bei der Endodermentwicklung spielt. Damit ist Sox17 ein idealer genetischer Marker der Endodermdifferenzierung. Das Ziel dieser Arbeit war es, die frühe Differenzierung von murinen ES Zellen in Sox17-exprimierende endodermale Zellen in vitro zu untersuchen und bisher nicht beschriebene Gene des endodermalen Keimblatts zu charakterisieren. Eine transgene ES Zelllinie wurde etabliert, die das rot-fluoreszierende DsRedExpress-Protein (DsRed) unter der Kontrolle des Sox17 Promotors exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass die ES-Zellen, die ihre Pluripotenz verlieren und endodermale Identität annehmen, das DsRed Transgen in vergleichbarer Weise zum endogenen Sox17 exprimieren und damit ein geeignetes in vitro Modell für Endoderm-Differenzierung darstellen. Die globale Analyse der Genexpression und Untersuchung der Gen-Ontologie zeigten, dass Sox17 exprimierende Zellen dem visceralen, parietalen und definitiven Endoderm zuzuordnen sind. Die Analyse des Transkriptoms erlaubte es zudem neue Endoderm-assozierte Gene zu identifizieren. Die Expression der Gene Prss3, Plet1, 061000O12Rik, Chsy3, 2210011C24Rik, Gm10664, Sel1l3, Cdh6, Slc22a23, Pkdcc, Gpr120, Ttc6 und 210300C02Rik im embryonalen Endoderm und in daraus abgeleiteten Organen in vivo konnte durch in situ Hybridisierung gezeigt werden. Darüber hinaus konnten mit , Rfx6, Cdh6 und 0610010O12Rik Gene identifiziert werden, deren Expression in vitro von SOX17 beeinflusst wird. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der in dieser Arbeit etablierten Zelllinie zur Identifizierung unbekannter Endoderm-assozierter Gene.

The major first step in embryonic development of vertebrates is the formation of three germ layers during the process of gastrulation - the ectoderm, the mesoderm and the endoderm. During gastrulation, embryonic cells of the epiblast loose their pluripotency and adopt different developmental fates. However, the underlying molecular mechanisms have not been fully elucidated. Embryonic stem cells (ESCs) derived from the epiblast largely express the same genes as the pluripotent epiblast cells and in vitro they can be differentiated into cell types of the above mentioned three germ layers. Therefore it is hypothesized that directed ESC differentiation begins with the transient expression of germ layer-specific genes. Endoderm formation in the vertebrate embryo occurs during distinct time periods. In the mouse, the definitive endoderm (DE) forms during gastrulation between day 6.0 and 7.5 of embryonic development, whereas parietal endoderm (PE) and visceral endoderm (VE) arise independently prior to gastrulation between day 4.5 and 5.0. DE gives rise to organs of the gastrointestinal and respiratory tract including thymus, lung, liver, pancreas and intestine, while PE and VE contribute to extra-embryonic tissues. The visceral endoderm surrounding most of the epiblast is important for the induction of embryonic body axes and head folds. Although VE and DE are formed independently during embryonic development, they share common functional and molecular properties. Both endoderm structures express the transcription factor Sox17 which plays a crucial role in endoderm development. Thus, Sox17 is thought to be an ideal marker molecule for endoderm differentiation. The aim of this project was to investigate the early differentiation of murine ES cells into embryoid bodies which express Sox17 and to discover and characterize previously unknown genes important for endoderm formation. For this purpose a transgenic ES cell line was established which expresses the red-fluorescent DsRedExpress (DsRed) protein under the control of the Sox17 promotor. It is shown that ES cells which loose their pluripotency and adopt an endodermal identity express the DsRed transgene in a Sox17 comparable manner. Therefore, the Sox17::DsRed ES cell line represents a suitable in vitro model for endoderm differentiation. Global analysis of gene expression and gene ontology showed that the Sox17 expressing cell population was composed of visceral, parietal and definitive endoderm cells. In addition, the analysis of the Sox17-specific transcriptome identified unknown endoderm- associated genes. In situ hybridisation detected expression of the genes Prss3, Plet1, 061000O12Rik, Chsy3, 2210011C24Rik, Gm10664, Sel1l3, Cdh6, Slc22a23, Pkdcc, Gpr120, Ttc6 and 210300C02Rik within the embryonic endoderm and related organs in vivo. The genes Ocln, Rfx6, Cdh6 and 0610010O12Rik were identified with their expression being directed by SOX17 in vitro. In summary, this work identified previously unknown endoderm-associated genes and made an important contribution to the characterisation of ES cell derived endodermal cell types.