Changing the copy number of transmitter transporters per vesicle - sorting versus expression under regime of day-night cycle

Abstract

The main players involved in synaptic neurotransmission are the synaptic vesicles (SVs), their associated proteins and transporters. Differences in the trafficking of individual synaptic vesicle proteins could target them to different recycling pathways changing rates of recycling and delivering them to different vesicle pools or compartments which could determine their functional characteristics. The present study focuses on the association of SV proteins with the plasma membrane and the effect of circadian rhythm on regulation of the amount of neurotransmitter transporters per vesicle. In the first part, studies were made to identify SV proteins at the plasma membrane during/after exocytosis. The pronase assay was developed to study which and how much SV proteins translocated to the plasma membrane in synaptosomes prepared from adult rat or mouse whole brain. Pronase is a mixture of proteolytic enzymes and respects the plasma membrane thereby avoiding cleavage of proteins on SV inside the synaptosome. The following results were obtained: 1) Considerable digestion of synaptotagmin and the vesicular glutamate transporters (VGLUTs) in synaptosomes followed by pronase digestion indicated occurrence of these proteins at the plasma membrane. 2) Increased digestion of the SV proteins synaptophysin, synaptotagmin and VGLUTs in synaptosomes followed by sucrose stimulation compared to resting conditions indicated that pronase digestion allows for tracking changes in the translocation of SV proteins to the plasma membrane between resting and stimulated conditions. In the second part, experiments were performed to study the influence of circadian rhythm on the amount of VGLUTs, the vesicular GABA (VGAT) and monoamine (VMAT2) transporters per vesicle. Significant time-of-the-day- dependent oscillations in the amount of VGLUT1 in SVs prepared from wild type mice were observed while these oscillations were not seen in synaptosomes. Digestion of mouse synaptosomes prepared at different times of the day revealed that more VGLUT was digested at noon (ZT6) compared to the start of the light period (ZT0) while digestion of synaptophysin and synaptotagmin was independent from diurnal cycling. The pronase digestion data reflects the amounts obtained with isolated SVs indicating a diurnal cycling of VGLUTs to the plasma membrane. In contrast to VGLUTs, the amount of the vesicular GABA transporter VGAT did not vary diurnally in SVs as well as in synaptosomes prepared from wild type and Per2Brdm1 mutant mice. However, when comparing the amount of VGAT in SVs and synaptosomes from mice kept in light-dark cycle with those of mice kept under complete darkness, a decrease in the amount of VGAT was observed. Thus, the presence of a light/dark cycle seems to be an additional signal for VGAT expression. Finally, higher amounts of VMAT2 was found in Per2Brdm1 mutant mice compared to wild type mice entrained in a light-dark cycle or kept in complete darkness indicating a Per2 dependent regulation of VMAT2. In summary, three important neurotransmitter transporters are regulated differently by circadian-dependent mechanisms 1) VGLUTs are sorted diurnally to the plasma membrane of the pre-synaptic terminal. 2) VGAT expression appears to depend at least partially on a light/dark cycle. 3) VMAT2 expression seems to be modulated by the Per2 gene.

Synaptische Vesikel (SVs) sind Schlüsselorganellen neuronaler Kommunikation. Allen SV ist eine Reihe von Transmembranproteinen und assoziierten Proteinen gemein. SV in Subpopulationen von Neuronen unterscheiden sich aber in ihrem jeweiligen vesikulären Transmittertransporter. Unterschiede in der Sortierung individueller synaptischer Vesikelproteine können die Proteinausstattung von SV-Subpopulationen verändern. Variationen in der Sortierung können daher die Funktion von SV-Subpopulationen beeinflussen. Die vorliegende Studie untersucht das Vorkommen von SV-Proteinen an der Plasmamembran und den Effekt zirkadianer Rhythmik auf die Umverteilung und Regulation vesikulärer Neurotransmittertransporter für Glutamat (VGLUT), GABA (VGAT) und Monoamine (VMAT2). Im ersten Teil wurde das Vorkommen von SV-Proteinen an der Plasmamembran vor und nach Stimulation erfasst. Hierzu wurden Synaptosomen einem partiellen Verdau mit einem Gemisch aus proteolytischen Enzymen (Pronase) unterworfen. Dabei werden nur die in den Extrazellulärraum reichenden Peptidketten abgedaut, während die zytosolischen Anteile der SV- Proteine verschont bleiben. Es wurden zunächst Synaptosomen aus dem Ratten- oder Mäusegehirn angedaut. Dabei ergaben sich folgende Befunde: 1) Ein deutlicher Verdau von Synaptotagmin und den VGLUTs als Folge der Pronasebehandlung an Synaptosomen zeigte das Auftreten von diesen Proteinen an der Plasmamembran. 2) Der erhöhte Verdau der SV-Proteine Synaptophysin, Synaptotagmin und von VGLUTs an Synaptosomen nach einer Saccharosestimulation zeigte, dass die Pronasebehandlung geeignet ist, die Verlagerung von SV- Proteinen an die Plasmamembran nach Stimulation zu verfolgen. Im zweiten Teil wurde der Einfluss zirkadianer Rhythmik auf ausgewählte synaptische Vesikelproteine und im Speziellen auf die Neurotransmittertransporter VGLUT1/2, VGAT und VMAT2 bezüglich deren Umverteilung und Regulation untersucht. Tageszeitlich abhängige Oszillationen wurden in der Menge von VGLUT1 in einer SV-Fraktion nicht aber in einer Synaptosomenfraktion, jeweils gewonnen aus Wildtypmäusen, beobachtet. Der Pronaseverdau von Maussynaptosomen zu verschiedenen Tageszeiten ergab ein tageszeitabhängiges Vorkommen der VGLUTs an der Plasmamembran. Die VGLUTs unterlagen mittags (ZT6) einem verstärkten Verdau verglichen mit dem Beginn der Lichtphase (ZT0), wohingegen der Verdau von Synaptophysin und Synaptotagmin unabhängig von der Tageszeit war. Die Pronaseexperimente spiegeln dabei die im Tagesverlauf oszillierenden Mengen an VGLUT wie sie an SV-Fraktionen gefunden wurden wider und belegen, dass VGLUT an die Plasmamembran sortiert wird. Im Gegensatz zu den VGLUTs unterliegt der vesikuläre GABA-Transporter VGAT von Wildtypmäusen oder Per2Brdm1-Mutanten keinen tageszyklischen Umverteilungen zwischen SVs und der Plasmamembran. Andererseits war bei Mäusen, die in kompletter Dunkelheit gehalten wurden, die VGAT-Menge in SV- und Synaptosomenfraktionen im Gegensatz zur Hell-Dunkel-Bedingung reduziert. Die Gegenwart eines Hell-Dunkel-Zyklus ist daher ein verstärkendes Signal für die VGAT-Expression. Schließlich wurde im Gegensatz zum Wildtyp eine erhöhte Menge des vesikulären Monoamintransporters (VMAT) 2 in der Per2Brdm1-Mutante im Hell-Dunkel- und Dunkel-Dunkel-Zyklus gefunden. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass drei wichtige Neurotransmittertransporter unterschiedlich durch zirkadian- abhängige Parameter reguliert werden. 1) Die VGLUTs werden tageszeitabhängig auf der Ebene der präsynaptischen Terminalien umsortiert. 2) Die VGAT- Expression ist von einem Hell-Dunkel-Zyklus abhängig. 3) Die VMAT2-Expression wird durch das Per2-Gen moduliert.