Silica Nanoparticles in Mouse Models of Skin Diseases: Local Penetration, Systemic Distribution and Effect on Allergic Contact Dermatitis

Abstract

Nanoparticles (NP) with a defined size less than 100 nm in at least one dimension possess completely new characteristics in comparison to the corresponding bulk material. The new characteristics are currently thought to enable various new applications. Thus, NP can nowadays be found in food, cosmetics and clothes as well as in electronic devices and paints. Recent developments led to biomedical applications, including drug delivery systems, antitumor therapy and medical imaging tools. Among promising candidates for further progress are silica nanoparticles (SiO2-NP). Among the various modification opportunities, a surface functionalization with N-(6-aminohexyl)-aminopropyltrimethoxysilane (AHAPS) has been successfully employed for subsequent DNA binding and gene delivery in vivo. However, the new properties of NP are not only promising for novel applications, they also have to be considered having a distinct biological behavior with potential unwanted or even toxic effects. The skin as the largest organ of the body is an important interface between the organism and intended as well as unintended NP contact. The penetration of NP through intact skin has been discussed controversially in recent years. In addition, skin barrier disruptions are very common. For example, allergic contact dermatitis (ACD) affects about 20 % of the people in western countries. But similar as for intact skin, studies on the penetration behavior of NP through a disrupted skin barrier have revealed contradictory results, too. However, most studies employed physical methods to induce a disruptive skin barrier. Only very few authors investigated the penetration of NP in inflammatory skin conditions. Moreover, several studies demonstrated an adjuvant capacity of NP, including unfunctionalized SiO2-NP. It was shown that SiO2-NP exposure during allergen sensitization resulted in an aggravation of inflammatory reaction in models of allergic skin diseases. However, no data on the outcome of an ACD exist when allergen and NP exposure are independent from each other. Consequently, in this in vivo study the role of skin barrier disruptions on the penetration of fluorescently labeled AHAPS- functionalized SiO2-NP was studied comparing a mechanical skin barrier disruption and an inflammatory skin disease with intact skin. As model for a mechanical skin barrier injury, the stratum corneum was removed by tape stripping. In case of the inflammatory skin disease, an ACD was induced with oxazolone. Following successful barrier perturbation, animals were treated with AHAPS-functionalized SiO2-NP with a single application or five treatments on five consecutive days, respectively. Controls received the AHAPS-SiO2-NP on intact skin and in two further groups the particles were injected subcutaneously. In all topically treated groups, AHAPS-functionalized SiO2-NP were only localized extracellular between the sheet of the stratum corneum despite severe barrier disruptions using fluorescence and transmission electron microscopy. No particles were detected in viable epidermal layers or in the dermis. Following subcutaneous injection, light microscopic examination revealed a moderate infiltration of immune cells, mainly macrophages, at the site of injection. All SiO2-NP showed a cellular association. The particles were mainly taken up by macrophages which were identified using specific markers. Only following five subcutaneous injections on five consecutive days, AHAPS-functionalized SiO2-NP were localized in the regional lymph node. The immuno-fluorescent as well as electron microscopic investigation suggested a particle transport to the lymph nodes via antigenpresenting cells. In addition to these findings, the light and electron microscopic analyses of the mice revealed no toxic effects in the macrophages of the draining lymph node despite an intracytoplasmic particle localization. In addition to the particle penetration behavior, the course and outcome of an ACD mouse model was studied in the presence of AHAPS-SiO2-NP. In addition to the clinical and histopathologic evaluation, the morphometric data, i.e., epidermal thickness, number of mast cells, eosinophils and CD4 positive cells, and the immunoglobulin E content in the serum revealed no significant differences between both treatment groups of ACD. Taken together, our results suggest that AHAPS-functionalized SiO2-NP are unable to penetrate intact and barrier disrupted skin beyond the stratum corneum. Moreover, no modulation of inflammatory reaction was observed in a mouse model of ACD. Consequently, other conditions or application routes have to be investigated in order to employ AHAPS-SiO2-NP in biomedical applications where a transdermal penetration is intended. As shown for subcutaneous injection, a five-day- treatment period resulted in a transport of AHAPSfunctionalized NP to the regional lymph node presumably via antigen-presenting cells. It seems that the AHAPS-SiO2-NP are inert particles which are treated by the body as insoluble foreign bodies. However, if no penetration of particles is desired, the conditions studied here might be a good start for further investigations.

Nanopartikel (NP) mit einer definierten Größe unter 100 nm in mindestens einer Dimension weisen völlig neue Eigenschaften im Vergleich zum entsprechenden, größer skalierten Grundmaterial auf. Diese neuartigen Eigenschaften ermöglichen den Einsatz in verschiedenen, neuen Anwendungen. So sind NP heutzutage Bestandteil von Nahrungsmitteln, Kosmetika und Kleidungsstücken, finden sich aber auch in elektronischen Geräten und Anstrichfarben. Jüngste Entwicklungen haben zu biomedizinischen Anwendungen, zum Beispiel als Arzneimitteltransporter, Tumortherapeutikum und Einsatz in der bildgebenden Diagnostik, geführt. Ein vielversprechender Kandidat für weiteren Fortschritt sind Silica-Nanopartikel (SiO2-NP). Unter den verschiedenen Modifizierungsmöglichkeiten hat sich eine Oberflächenfunktionalisierung mit N-(6-aminohexyl)aminopropyltrimethoxysilane (AHAPS) für die Bindung von DNA und anschließendem in vivo Gentransport als vielversprechend erwiesen. Allerdings sind die neuen Eigenschaften der NP nicht nur vielversprechend für neue Anwendungen, auch ein unterschiedliches biologisches Verhalten mit potenziell unerwünschten oder sogar toxischen Folgen muss in Betracht gezogen werden. Die Haut ist als größtes Organ des Körpers eine wichtige Grenzfläche zwischen dem Organismus und sowohl beabsichtigtem als auch unbeabsichtigtem NP-Kontakt. Die Penetration von Nanopartikeln durch die intakte Hautbarriere wurde in den letzten Jahren kontrovers diskutiert. Zudem sind Hautbarrierestörungen weit verbreitet. Beispielsweise leiden etwa 20 % der Menschen in westlichen Ländern an einer allergischen Kontaktdermatitis (ACD). Ähnlich wie für die gesunde Haut ergaben Studien zum Penetrationsverhalten von NP durch eine gestörte Hautbarriere widersprüchliche Ergebnisse. Hinzu kommt, dass in den meisten dieser Studien physikalische Methoden zur Störung der Hautbarriere angewendet wurden. Nur wenige Autoren untersuchten das Penetrationsverhalten von NP in entzündlichen Hauterkrankungen. Ferner zeigten mehrere Studien eine Adjuvans-Wirkung von NP, unter anderem auch für unfunktionalisierte SiO2-NP. So konnte nachgewiesen werden, dass eine SiO2-NP- Exposition während der Allergensensibilisierung zu einer verstärkten Entzündungsreaktion allergischer Hauterkrankungen im Mausmodell führte. Jedoch fehlen Daten zum Ausgang einer ACD, wenn die Allergensensibilisierung und die SiO2-NP-Exposition unabhängig voneinander erfolgen. Folglich wurde in dieser in vivo Studie die Rolle von Hautbarrierestörungen auf die Penetration von fluoreszenzmarkierten AHAPS-funktionalisierten SiO2-NP untersucht, indem eine mechanische Hautbarrierestörung und eine entzündliche Hauterkrankung mit dem Penetrationsverhalten in intakter Haut verglichen wurden. Als Modell einer mechanischen Hautbarrierestörung wurde das Stratum corneum mittels Klebestreifen entfernt. Im Fall der entzündlichen Hauterkrankung wurde eine ACD mit Oxazolon induziert. Nach erfolgreicher Barrierestörung erhielten die Tiere die AHAPS-funktionalisierten SiO2-NP einmalig beziehungsweise fünf Behandlungen an fünf aufeinander folgenden Tagen. Die Kontrollen erhielten die AHAPS-SiO2-NP auf die intakte Haut und zwei weiteren Gruppen wurden die Partikel subkutan injiziert. In allen topisch behandelten Gruppen konnten trotz schwerwiegender Barrierestörung die AHAPS-funktionalisierten SiO2-NP nur extrazellulär zwischen den Lagen des Stratum corneums mittels Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie lokalisiert werden. Keine Partikel konnten in den lebenden epidermalen Schichten oder der Dermis detektiert werden. Nach subkutaner Injektion ergab die histologische Untersuchung der Injektionsstelle eine moderate Infiltration mit Immunzellen, vorrangig Makrophagen. Alle SiO2-NP zeigten eine zelluläre Assoziation. Die Partikel wurden überwiegend von Makrophagen aufgenommen, welche mittels spezifischen Markern identifiziert wurden. Erst nach fünf Injektionen an fünf aufeinander folgenden Tagen konnten die AHAPSfunktionalisierten SiO2-NP im regionalen Lymphknoten lokalisiert werden. Die Immunfluoreszenz und die elektronenmikroskopische Untersuchung deuten auf einen Partikeltransport in die Lymphknoten via antigenpräsentierende Zellen hin. Zudem ergaben sich aus der licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchung der Mäuse keine Hinweise auf toxische Effekte in den Makrophagen der drainierenden Lymphknoten keine Hinweise auf toxische Effekte trotz intrazytoplasmatischer Partikellokalisation. Neben dem Penetrationsverhalten der Partikel wurde der Verlauf und Ausgang einer ACD im Mausmodell untersucht. Zusätzlich zu der klinischen und histopathologischen Untersuchung konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Behandlungsgruppen der ACD in den morphometrischen Daten, das heißt epidermale Dicke, Anzahl der Mastzellen, eosinophilen Granulozyten und CD4 positiven Zellen, sowie dem Gehalt an Immunglobulin E im Serum festgestellt werden. Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse dieser Studie dafür, dass AHAPSfunktionalisierte SiO2-NP nicht in der Lage sind, eine intakte oder gestörte Hautbarriere über das Stratum corneum hinaus zu überwinden. Zudem konnte keine Beeinflussung auf die Entzündungsreaktion im Mausmodell einer ACD beobachtet werden. Als Konsequenz lässt sich daraus schließen, dass für eine Verwendung von AHAPS-SiO2-NP in biomedizinischen Anwendungen, in denen eine transdermale Penetration angestrebt ist, andere Bedingungen oder Applikationswege in Betracht gezogen und untersucht werden müssen. Beispielsweise transportierten mutmaßlich antigenpräsentierende Zellen nach fünftägiger subkutaner Injektion die AHAPS-funktionalisierte SiO2-NP in den regionalen Lymphknoten. Es scheint, dass AHAPS-SiO2-NP inerte Partikel sind, die vom Körper wie nicht lösliche Fremdkörper behandelt werden. Wird jedoch eine Anwendung angestrebt, in der eine Partikelpenetration unerwünscht ist, sind die hier untersuchten Bedingungen ein guter Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen.