Mineral deposition and maturation during bone development

Abstract

Biomineralization in invertebrates and vertebrates has been intensively investigated over the last decades. One biomineralization strategy often discussed today is mineralization via transient precursor phases. In vertebrate mineralized tissues, the possible formation of an amorphous precursor mineral phase is still an unresolved question. Recent studies suggest the existence of amorphous calcium phosphate (ACP) as the first formed mineral in developing enamel of mice or in zebrafish fin. Whereas the mineralization in zebrafish fin progresses linearly, the mineralization process in mammalian bone is more complex and only little is known about early phases during this process. This motivated us to investigate developing bone in mammals using different techniques such as synchrotron X-ray diffraction experiments and electron microscopy. In the present doctoral thesis, developing bone in murine long bones has been investigated, especially at the early stages of bone formation. Normal mice were compared to knockout mice with neurofibromatosis type 1 (NF1) based on the same strain, C57BL/6. Furthermore, the development of bone within tissue engineering scaffolds in a pig model has been analyzed. Mineral particle thickness and arrangement were characterized in developing bone by small-angle X-ray scattering (SAXS) combined with wide-angle X-ray diffraction (WAXD), providing mineral length and the amount of hydroxyapatite (HA), as well as X-ray fluorescence (XRF) analysis, revealing the calcium content. During bone development, SAXS revealed a complete lack of mineral particle orientation at the fetal stages, whereas one day after birth the mineral particles were predominantly aligned parallel to the longitudinal axis of the bone. Strong differences were found in size and orientation of the mineral particles between fetal and postnatal bone, with bulkier (thicker, shorter) and randomly oriented particles at the fetal stage, and highly aligned and much longer crystals after birth. This could indicate the existence of two different types of bone tissue appearing successively during bone growth and coexisting in mature bone. The inherited disorder NF1 results in a bone and cartilage phenotype, but there were no significant differences in the mineral properties detectable by SAXS between NF1 and normal bone. However, subsequent investigations on the microstructure clearly displayed morphological differences of the osteocyte lacunae: NF1 bone revealed osteocyte lacunae less uniform, frayed and bigger than in normal bone. These results suggest that the osteocytes may be involved in the bone defect in NF1 mice. Bone development induced by resorbable scaffolds, implanted in a critical sized defect in the porcine calvaria appeared to be quit different. SAXS revealed huge structural differences between tissue engineered bone and the native calvaria. Whereas mineral particles around cavities in the calvaria showed no preferential orientation, in the tissue engineered bone they were strongly oriented around the struts of the scaffold which seem to guide the bone formation. These results demonstrate that the implanted scaffolds led to long-term regeneration and remodeling of highly organized bone. In summary, it was shown that during bone growth the formation of highly ordered tissue follows the initial development of a less ordered bony substrate, while it forms directly in a tissue engineered scaffold.

Biomineralisation in Invertebraten und Vertebraten wurde in den letzten Jahrzehnten intensiv untersucht. Eine häufig diskutierte Strategie der Biomineralisation ist die Mineralisation ausgehend von einer kurzlebigen Vorläufer-Mineralphase. Für mineralisierte Gewebe in Vertebraten ist die mögliche Bildung einer amorphen Mineral-Vorstufe noch immer eine ungeklärte Frage. Neueste Arbeiten deuten auf die Existenz von amorphem Kalzium Phosphat (ACP) als initial gebildete Mineralphase in der frühen Phase der Bildung von Zahnschmelz in Mäusen oder in Zebrafisch-Flossen hin. Während die Mineralisation in Zebrafisch-Flossen linear verläuft, ist der Mineralisationsprozess im Säugetier-Knochen wesentlich komplizierter und es ist nur wenig zu den frühen Phasen dieses Prozesses bekannt. Dies motivierte uns, die Knochenbildung in Säugetieren mit Hilfe verschiedener Methoden, wie Synchrotron-Röntgen-Experimenten und Elektronenmikroskopie, zu untersuchen. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde die Bildung von Röhrenknochen in Mäusen untersucht, mit besonderem Interesse an den frühen Phasen der Knochenbildung. Wildtyp Mäuse wurden verglichen mit genetisch veränderten Mäusen mit Neurofibromatose Typ 1 (NF1), welche auf dem gleichen Stamm, C57BL/6, basieren. Außerdem wurde die Knochenbildung in „Tissue Engineering“ Konstrukten in der Calvaria von Schweinen untersucht. Mineralpartikeldicke und deren Anordnung wurden mit Hilfe der Röntgen-Kleinwinkel-Streuung (SAXS) charakterisiert, verbunden mit Röntgen-Weitwinkel-Beugung (WAXD) zur Analyse der Mineralpartikellänge und des Gehaltes an Hydroxyapatit (HA), sowie Röntgen-Fluoreszenzanalyse (XRF), zur Bestimmung des Kalzium Gehaltes in der Probe. Im Verlauf der Knochenbildung zeigte die SAXS Analyse, dass die Mineralpartikel in Knochen der fötalen Stadien der Knochenbildung keine Orientierung aufweisen, wohingegen die Mineralpartikel bereits einen Tag nach der Geburt vorzugsweise parallel zur Längsachse des Knochens ausgerichtet waren. Bemerkenswerte Unterschiede bezüglich Größe und Orientierung der Mineralpartikel zwischen fötalem und postnatalem Knochen wurden aufgezeigt; und zwar dicke, kurze und unorientierte Mineralpartikel im fötalen Knochen und stark orientierte und wesentlich längere Mineralpartikel im postnatalen Knochen. Dies könnte darauf hindeuten, dass es sich um zwei verschiedene Formen von Knochengewebe handelt, welche im Verlauf der Knochenbildung nacheinander auftreten und in entwickeltem Knochen nebeneinander vorliegen. Bei einer NF1-Erkrankung kommt zur Ausprägung eines Knorpel- und Knochenphänotyps, jedoch zeigten SAXS-Messungen keinen signifikanten Unterschied bezüglich der Mineralpartikeleigenschaften zwischen NF1- und normalem Knochen. Allerdings zeigten anschließende Untersuchungen der Mikrostruktur morphologische Unterschiede der Osteozytenlakunen. NF1 Knochen wies weniger einheitliche, ausgefranste und größere Osteozytenlakunen auf, als normaler Knochen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Osteozyten eventuell am Knochendefekt in NF1 Mäusen beteiligt sind. Die Knochenbildung, induziert durch resorbierbare Konstrukte, implantiert in einen Defekt von kritischer Größe in der Calvaria von Schweinen scheint anders zu verlaufen. SAXS Messungen zeigten deutliche Unterschiede zwischen Knochen, welcher in einem Konstrukt gebildet wurde, und dem nativem Schädelknochen. Während die Mineralpartikel in der Calvaria keine Vorzugsorientierung um Hohlräume (beispielsweise Osteozyten) aufwiesen, waren sie im Konstrukt stark um die Streben des Konstrukts orientiert, welche scheinbar die Knochenbildung leiten. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass implantierte Konstrukte zu Langzeit- Regeneration und Umbau von stark organisiertem Knochengewebe führen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass im Verlauf der Knochenentwicklung die Bildung von hoch organisiertem Knochengewebe auf die Bildung eines wenig geordneten Knochensubstrates folgt, wohingegen in einem Konstrukt direkt hoch geordnetes Knochengewebe gebildet wird.