Struktur-Funktions-Untersuchungen an cyanobakteriellem Phytochrom 1

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene biophysikalische Methoden zur Untersuchung der Photochromizität des N-terminalen Teils von cyanobakteriellem Phytochrom 1 (Cph1d2) angewendet. Es wurde ein biosynthetisches Protokoll zur uniformen Markierung und Reinigung von Phycocyanobilin (PCB) mit 13C und/oder 15N entwickelt. Damit konnte die notwendige Vorraussetzung für eine differentielle Markierung Protein/Chromophor geschaffen werden. Durch analytische Ultrazentrifugation konnte eine Dimerisierung sowohl der Pr- als auch der Pfr-Form von Cph1d2 nachgewiesen werden. Weiterhin wurde gezeigt, daß die Pfr-Form eine deutlich stärkere Dimerisierung aufweist. Diese verstärkte Dimerisierung ist photoreversibel und spezifisch und hat möglicherweise Bedeutung bei der intramolekularen Signalweiterleitung der Phototransformation im nativen dimeren Cph1-Molekül. Es konnten homonukleare 1H-1H-NOESY-Spektren des Chromophors im deuterierten Protein aufgenommen werden, der Deuterierungsgrad des Apoproteins ist jedoch nicht hinreichend, um eine eindeutige Identifikation und Zuordnung der Chromophorsignale zu erreichen. 1H-15N-HMQC-Spektren des Chromophors zeigen Hinweise auf einen beweglichen und/oder deprotonierten Chromophor in beiden spektralen Zuständen. 1D-15N- Spektren des Chromophors zeigen, daß PCB in beiden spektralen Zuständen vollständig protoniert ist. 1H-13C-HMQC-Spektren ergaben weitere Hinweise auf einen in seiner Bindungstasche relativ beweglichen Chromophor. Durch die Verwendung unterschiedlicher Markierungsmuster konnte eine umfassende Modenzuordnung von Resonanz-Raman-Spektren der Pr- und der Pfr-Form erreicht werden. Die gemessenen Spektren zeigen ebenfalls einen protonierten Chromophor in beiden spektralen Zuständen an. Der Vergleich zwischen berechneten und gemessenen Spektren erlaubt eine Konfigurations- und Konformationsbestimmung des Chromophors. Für die Pr-Form wird eine 5Z,anti-10Z,syn-15Z,anti- Konformation und Konfiguration, für die Pfr-Form wird eine 5Z,syn-10Z,syn-15E ,anti-Konformation und Konfiguration vorgeschlagen. Der Vergleich zwischen berechneten und gemessenen 15N-chemischen Verschiebungen führt zum selben Ergebnis hinsichtlich der Struktur von PCB.

In this work several biophysical methods were used to study the photochromicity of the N-terminal part of cyanobacterial phytochrome 1 (Cph1d2). A protocol for the uniform labelling and purification of phycocyanobilin (PCB) with 13C- and/or 15N has been developed. Thus, the necessary requirement for differential labelling of protein and chromophor is met. Using analytical ultracentrifugation, dimerisation of both the Pr- and the Pfr-form could be shown. Furthermore, it was shown that dimerisation of the Pfr-form is much stronger. This stronger dimerisation is photoreversible and specific and possibly is signifcant in mediating the intramolecular signal transduction of the phototransformation in the native dimeric Cph1-molecule. It was possible to obtain homonuclear 1H-1H-NOESY-spectra of the chromophore in a deuterated protein, however, the degree of deuteration of the apoprotein is not sufficient to allow for an unambiguous identification and assignement of the signals arising from the chromophore. 1H-15N-HMQC-spectra of the chromophore indicate a mobile and/or deprotonated chromophore in both spectral forms. 1D-15N-spectra of the chromophore show that PCB is fully protonated in both spectral forms. Additionally, 1H-13C-HMQc-spectra indicate a rather mobile chromophore in its binding pocket. Using different labelling patterns, a comprehensive spectral assignement could be achieved for resonance-raman- spectra of the Pr- and the Pfr-form. The measured spectra also indicate a protonated chromophore in both spectral forms. Comparison of calculated with the measured spectra allows the determination of the conformation and configuration of the chromophore. A 5Z,anti-10Z,syn-15Z,anti-conformation and configuration is proposed for the Pr-form, in case of the Pfr-form, a 5Z,syn- 10Z,syn-15E,anti-conformation and configuration is proposed. Comparison of calculated and measured 15N-chmemical shifts yields the same result regarding the structure of PCB.