Analysis of the expression pattern and knock-out phenotype of Slit-like 2 (Slitl2) in the mouse

Abstract

The murine Slit-like 2 (Slitl2) gene was first identified in 2002, and so far, no reports have been published on it. This thesis aimed at answering two basic questions when first analyzing the function of a gene: a) Where is the gene expressed? and b) What happens if the gene function is abolished? A variety of different studies have been performed to address the role of Slitl2 in the mouse. A comprehensive temporospatial expression pattern was provided by describing not only endogenous Slitl2 expression, but also reporter gene expression in Slitl2-LacZ knock-in and in Slitl2-Venus transgenic mice. All three approaches rendered consistent results and revealed widespread expression from early developmental stages onwards. Prominent expression was observed in the developing as well as the adult skeletal system. Likewise, vascular smooth muscle cells and glomeruli exhibited strong expression throughout all stages of development. Moderate expression was, for example, seen in the adult lung epithelium and pancreatic islets of Langerhans. Collectively, the findings from the expression analysis indicated important roles for Slitl2 in the mouse. Non-redundant functions of Slitl2 could indeed be demonstrated by the generation of Slitl2-deficient mice via classical gene targeting in embryonic stem cells. Slitl2-mutant mice are phenotypically indistinguishable from their wild-type littermates at birth but develop a progressive illness and succumb to renal failure by 3-4 weeks of age. Prenatal kidney development appears unimpaired, and defects only emerge after birth. Renal insufficiency in these mice is characterized by severe glomerular lesions with massive podocyte effacement, capillary ectasia or even complete atrophy of the capillary tufts. Slitl2-deficient mice develop nephrotic syndrome with massive proteinuria and severe hypalbuminemia, which ultimately causes hyaline droplet nephropathy as well as subcutaneous edema, hydrothorax, and ascites. In addition, moribund null mutants are uremic, which further reflects renal failure in these animals. Despite the fact that kidney failure inevitably entails a perturbed bone metabo-lism, the decreased bone density in conjunction with a low bone turnover in Slitl2-deficient mice could also be a direct cause of the gene inactivation with regard to the distinct expression of Slitl2 in the skeletal system already at embryonic stages. The marked splenic and thymic atrophy in moribund Slitl2-deficient mice, on the other hand, could be attributed to increased serum levels of corticosterone and are therefore considered to be secondary effects. This thesis has laid the groundwork for future studies which will have to address the exact mechanism of the glomerular defects of the Slitl2 mutants and elucidate the underlying signaling pathway. With millions of people affected with kidney disease, this mouse model may serve as a valuable tool for in vivo studies and for testing potential therapeutic modalities.

Das Gen Slit-like 2 (Slitl2) der Maus wurde erstmals im Jahr 2002 identifiziert. Bis dato gibt es noch keine Veröffentlichungen diesbezüglich. Mit der vorliegenden Arbeit sollten zwei grundlegende Fragen geklärt werden, die im Zusammenhang mit einem neu identifizierten Gen auftreten: a) Wo ist das Gen exprimiert? und b) Was passiert, wenn das Gen ausgeschaltet wird? Die Analyse des Expressionsmusters erfolgte anhand der Beschreibung sowohl der endogenen Slitl2 Expression, als auch der Reportergenexpression in Slitl2-LacZ knock-in und Slitl2-Venus-transgenen Mäusen. Alle drei Herangehensweisen lieferten übereinstimmende Ergebnisse und zeigten verbreitete Slitl2-Expression bereits in frühen Phasen der Embryonalentwicklung. Besonders ausgeprägte Expression wurde sowohl im sich entwickelnden wie auch im erwachsenen Skelett beobachtet. Gleichermaßen zeigten glatte Gefäßmuskelzellen sowie Glomeruli starke Expression in allen Stadien der Entwicklung. Mäßige Expression wurde u.a. in den Lungenepithelzellen und den Langerhansschen Inselzellen des Pankreas der adulten Maus festgestellt. Insgesamt ließen die Ergebnisse der Expressionsanalyse bereits eine wichtige Rolle für das Gen in der Maus vermuten. Essentielle Funktionen des Gens Slitl2 konnten durch die Erzeugung Slitl2-defizienter Mäuse mit Hilfe der Inaktivierung des Gens in embryonalen Stammzellen nachgewiesen werden. Anfänglich sind die Mausmutanten nicht von ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern zu unterscheiden, erkranken aber zunehmend und sterben schließlich an Nierenversagen im Alter von 3-4 Wochen. Die pränatale Nierenentwicklung scheint nicht beeinträchtig zu sein, treten doch die Schädigungen erst nachgeburtlich auf. Die Niereninsuffizienz dieser Tiere wird durch schwere Läsionen der Glomeruli ausgelöst, welche durch Verschmelzung der Podozyten-Fußfortsätze und Kapillarektasie bis hin zur Atrophie des Kapillarknäuels gekennzeichnet sind. Slitl2-defiziente Mäuse entwickeln ein nephrotisches Syndrom mit massiver Proteinurie und hochgradiger Hypalbuminämie. Eine hyalintropfige Speicherungsnephrose sowie subkutane Ödeme, Hydrothorax und Ascites sind die Folge. Das Nierenversagen zeigt sich zudem in Form einer ausgeprägten Urämie. Niereninsuffizienz zieht unausweichlich eine Beeinträchtigung des Knochenstoffwechsels nach sich. Dennoch könnte es sich bei der reduzierten Knochendichte der Slitl2-defizienten Tieren, die mit einem reduzierten Knochenumsatz vergesellschaftet ist, auch um eine direkte Auswirkung der Geninaktivierung handeln, berücksichtigt man die starke Expression von Slitl2 in den Knochen schon ab embryonalen Phasen der Entwicklung. Im Gegensatz dazu stellen die ausgeprägte Atrophie von Milz und Thymus bei moribunden Slitl2-defizienten Mäusen möglicherweise einen Sekundäreffekt dar, ausgelöst durch erhöhte Corticosteronwerte im Serum. Diese Arbeit hat die Grundlagen für zukünftige Untersuchungen geschaffen, die sich mit dem genauen Mechanismus der glomerulären Läsionen befassen und den zugrunde liegenden Signaltransduktionsweg identifizieren sollten. Weltweit sind Millionen von Menschen von Nierenerkrankungen betroffen. Slitl2-defiziente Mäuse könnten somit als wertvolles Tiermodell für in vivo-Studien und zur Erforschung neuer Therapieansätze dienen.