The Impact of Distinct Bone Morphogenetic Proteins on Self-Renewal and Differentiation of Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Abstract

Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are a large and evolutionarily highly conserved family of biologically active cytokines that belong to the Transforming Growth Factor-beta (TGF-β) superfamily. They act as agonists of cell surface receptors and exert pleiotropic functions during all stages of life in multicellular animals. With respect to human pluripotent stem cells, it has been shown that BMPs can induce differentiation into embryonic (mesoderm, endoderm, germ cells) and extraembryonic (primitive endoderm, trophoblast) lineages. To date, BMP4 has served as the “standard BMP” for model studies related to these cells, although the BMP family consists of more than 20 members. Therefore, this research project aimed at investigating the potential effects of distinct BMPs on human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). BMP5, BMP10 and BMP13 were chosen, since these proteins represent members of different BMP subgroups based on sequence homology, and are known for their different physiological roles in vivo. The results showed − in agreement with previous BMP4 model studies − that all three ligands trigger these cells to differentiate into derivatives of the trophoblast lineage in the absence of exogenous Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF). However, the individual BMPs exhibited differences in the kinetics of induced differentiation as a consequence of receptor complexity existing for BMP signaling, with BMP10 being the most potent ligand. hESCs (derived from pre-implantation blastocysts) and hiPSCs (generated by reprogramming of somatic cells) shared comparable expression patterns of BMP-related TGF-β superfamily type-I and type-II receptor subtypes. This could explain the same properties with respect to ligand potency and activation of SMAD-dependent (via SMAD1/5/8) and SMAD-independent (via MAPK p38) signal transduction pathways between both types of pluripotent stem cells. The adaptation of receptor expression profile occurred during the reprogramming process of somatic cells to hiPSCs. The tested BMPs had both unique and shared target genes, such as CDX2, DLX3, DLX5, GATA2, GATA3, HAND1, ID2, MSX2 and TFAP2A, known to be associated with the emergence of trophoblast cells. BMP stimulation activated in hESCs the expression of the BMP antagonist Noggin as a negative feedback mechanism to restrict extensive BMP action. Unlike BMP4, BMP10 is resistant to inhibition by Noggin. In summary, this work has shed light on the induction of trophoblast differentiation in human pluripotent stem cells by individual BMP family members. Comparative global gene expression analyses and signal transduction studies revealed the molecular mechanisms which lead for distinct ligands to a collective differentiation fate. Moreover, several over- and underrepresented signaling, metabolic and other pathways as well as cellular components were identified during the course of BMP-mediated trophoblast differentiation. These provide insights into the biochemical and morphological processes that might mimic human placentation in vitro. Recombinant BMPs, especially BMP4, are used as cell fate inducers in many differentiation protocols applying more stringent culture conditions based on human pluripotent stem cells. In this regard, the present work has unveiled three additional cytokines that can be implemented into protocols for the directed differentiation of hESCs/hiPSCs to derive clinically relevant cell types for future regenerative therapies.

Knochenmorphogenetische Proteine (englisch: Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) bilden eine große und evolutionär stark konservierte Familie biologisch aktiver Zytokine, die zur Transformierenden Wachstumsfaktor-beta - Superfamilie (englisch: Transforming Growth Factor-beta, TGF-β) gehören. Sie wirken als Agonisten von Zelloberflächenrezeptoren und üben pleiotrope Funktionen in allen Lebensphasen von multizellulären Tieren aus. In Bezug auf humane pluripotente Stammzellen wurde gezeigt, dass BMPs eine Differenzierung zu embryonalen (Mesoderm, Endoderm, Keimzellen) und extraembryonalen (primitives Endoderm, Trophoblast) Abstammungslinien induzieren können. Das bis heute in entsprechenden Modellstudien üblicherweise verwendete BMP ist BMP4, obwohl die BMP-Familie aus über 20 Mitgliedern besteht. Deshalb wurden in diesem Forschungsprojekt die potenziellen Effekte untersucht, die verschiedenartige BMPs auf humane embryonale Stammzellen (hESCs) und humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) ausüben. Hierfür wurden BMP5, BMP10 und BMP13 ausgewählt, weil diese Proteine aufgrund ihrer Sequenzhomologie Mitglieder verschiedener BMP-Untergruppen repräsentieren, und für ihre unterschiedlichen physiologischen Funktionen in vivo bekannt sind. Die Ergebnisse zeigten − in Übereinstimmung mit bisherigen BMP4-Modellstudien − dass alle drei Liganden in Abwesenheit von exogenem Basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) eine Differenzierung dieser Zellen zu Derivaten der Trophoblastlinie auslösen. Jedoch wurden Unterschiede in der Kinetik der induzierten Differenzierung zwischen den individuellen BMPs festgestellt, die eine Konsequenz der für BMP-Signaltransduktion existierenden Rezeptorkomplexität sind, wobei BMP10 der stärkste Ligand war. hESCs (aus Blastozysten im Präimplantationsstadium isoliert) und hiPSCs (durch Reprogrammierung somatischer Zellen erzeugt) wiesen vergleichbare Expressionsmuster an Unterarten von BMP-zugehörigen Typ-I- und Typ-II- Rezeptoren der TGF-β-Superfamilie auf. Dies könnte die gleichen Eigenschaften hinsichtlich der Wirkungsstärke der Liganden und der Aktivierung von SMAD- abhängigen (via SMAD1/5/8) und SMAD-unabhängigen (via MAPK p38) Signaltransduktionswegen zwischen beiden Arten von pluripotenten Stammzellen erklären. Die Anpassung des Rezeptorexpressionsprofils fand während des Vorgangs der Reprogrammierung von somatischen Zellen zu hiPSCs statt. Die getesteten BMPs hatten sowohl einzigartige als auch gemeinsame Zielgene, wie zum Beispiel CDX2, DLX3, DLX5, GATA2, GATA3, HAND1, ID2, MSX2 und TFAP2A, die bekanntermaßen mit der Entstehung von Trophoblastzellen in Verbindung stehen. BMP-Stimulation aktivierte in hESCs die Expression des BMP-Antagonisten Noggin als einen negativen Rückkopplungsmechanismus, um extensive BMP-Signalwirkung einzuschränken. Im Gegensatz zu BMP4 ist BMP10 resistent gegen Inhibition durch Noggin. Zusammenfassend hat diese Arbeit die Wissenslücke über die Induktion von Trophoblastdifferenzierung in humanen pluripotenten Stammzellen durch individuelle BMP-Familienmitglieder geschlossen. Vergleichende globale Genexpressionsanalysen und Signaltransduktionsstudien deckten die molekularen Mechanismen auf, welche für verschiedenartige Liganden zu einem kollektiven Differenzierungsschicksal führen. Darüber hinaus wurden im Verlauf der BMP- vermittelten Trophoblastdifferenzierung mehrere über- und unterrepräsentierte Signal-, Stoffwechsel- und andere Pathways sowie zelluläre Bestandteile identifiziert. Diese geben Einblicke in die biochemischen und morphologischen Prozesse, die humane Plazentation in vitro imitieren könnten. Rekombinante BMPs, vor allem BMP4, sind Bestandteil vieler Differenzierungsprotokolle, mit denen unter strengen Zellkulturbedingungen die Spezialisierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu bestimmten gewünschten Zelltypen erreicht wird. In diesem Zusammenhang hat die vorliegende Arbeit drei weitere Zytokine aufgedeckt, die in Protokolle für die zielgerichtete Differenzierung von hESCs/hiPSCs implementiert werden können, um klinisch relevante Zelltypen für zukünftige regenerative Therapien herzustellen.