Genomweite differentielle DNA Methylierung im Knochen von neonatalen versus adulten C57BL/6 Mäusen

Abstract

DNA Methylierung ist eine epigenetische Veränderung, welche die Genexpression während Embryogenese, Entwicklung, Alterung und Kanzerogenese moduliert. Eine DNA Hypermethylierung führt in Promotorregionen innerhalb von CpG Inseln zu "`Gensilencing"'. Lange war die Analyse von 5-Methylcytosin nur für einzelne ausgewählte Fragmente möglich. Seit kurzer Zeit ist durch NGS die genomweite Sequenzierung und somit auch die genomweite Analyse von Methylierungsmustern möglich geworden. Bekannte Methoden sind die MeDIP-, die MBD- und der Goldstandard die Bisulfit-Sequenzierung. Zur Verringerung der Menge an Sequenzen prägte besonders A. Meissner die "`Reduced Representation Bisulfit"'-Sequenzierung, bei der nach einem enzymatischen Verdau und einer Größenselektion gewünschte Regionen angereichert werden. Für meherere Gewebe sind bereits genomweite Methylierungsmuster, sog. Methylome, erstellt worden, jedoch noch nicht für das Gewebe Knochen. Wir haben Calvariae und Femora von neonatalen und adulten C57BL/6-Mäusen präpariert und eine "`Reduced Representation Bisulfite"' Sequenzierung mit Msp1, einem Protokoll das von Smith et al. entwickelt wurde und CpG Inseln in Promotoren anreichert, durchgeführt. Nach einer Optimierung des Protokolls konnten die Calvaria Proben erfolgreich mit dem Illumina GAIIx sequenziert und Regionen differentieller Methylierung (DMRs) zwischen neonatalen und adulten Osteoblasten identifiziert werden. Insgesamt wurden 605 DMRs identifiziert; davon liegen 166 im Bereich eines Gens und neun innerhalb von Promotorregionen. Cdh1, Zfhx3, Cct8l1, Il11, Fgfrl1, Shroom4, Shc2, Pstpip1 und Acn9 weisen zwischen neonatalen und adulten Calvariae differentielle Methylierung auf. Cdh1, Zfhx3, Cct8l1, Il11 und Fgfrl1 sind in den neonatalen Calvariae hypermethyliert; Shroom4, Shc2, Pstpip1 und Acn9 dagegen in den adulten. Bei E-Cadherin, Zinkfingerprotein 3, Fgfrl1 und Interleukin 11 ist eine Beteiligung im Knochenstoffwechsel und der -entwicklung bereits bekannt. Unsere Ergebnisse legen eine Regulation dieser Gene im Knochenstoffwechsel über DNA Methylierung nahe. Bei Cct8l1, Shroom4, Shc2, Pstpip1 und Acn9 ist eine Rolle im Knochenstoffwechsel ebenfalls zu vermuten. Es wurden weitere im Knochenstoffwechsel bekannte Gene, die DMRs im Exon oder Intron aufwiesen im Zellkulturlabor untersucht. Die Zellinie MC3T3-E1 subclone4 und pCOBs wurden hierfür mit unterschiedlichen Konzentrationen 5-Azacitidin demethyliert und anschließend Expressionsanalysen mittels qPCR durchgeführt. Diese ergab keine Änderungen der Expression mit zunehmender Demethylierung. Dies stüzt die bereits in anderen Geweben festgestellte fehlende Auswirkung von DNA Methylierung in diesen Regionen auf die Genexpression. Bei einer Expressionsanalyse während der Differenzierung von Osteoblasten im Zellkulturlabor zeigte sich eine signifikante Expressionszunahme von Bmp8 und rPhex, die allerdings nicht durch DNA Methylierung reguliert zu sein scheint. Eine Validierung der DMRs mit "`Ultradeep Bisulfite"' Sequenzierung war nicht erfolgreich. Die Bisulfit-PCR als erster Schritt konnte aufgrund der erschwerten Anlagerung der Primer an die Bisulfit-konvertierte DNA nicht etabliert werden.

DNA methylation is an epigenetic mechanism which has an already well described influence on embryogenesis, development, aging and carcinogenesis. DNA hypermethylation usually appears in promotor regions within CpG islands and induces "`genesilencing"' of the related gene. A common method to analyze 5-methylcytosine at single-base resolution is Bisulfite-Sequencing. Recently, genome-wide approaches of methylation analysis have become feasible by the development of NGS. Common methods are MeDIP-, MBD- and the gold standard Bisulfite-Sequencing. To improve high costs and throughput a method called "`Reduced-Representation-Bisulfite-Sequencing"'(RRBS) was developed. RRBS includes a preparation protocol with an enzymatic digestion of the sample DNA and a size selection step to enrich selected fragments. These methods led to a genome-wide mapping of DNA methylation patterns called methylomes. Methylomes for several tissues exist by now, though not for the tissue bone. We harvested calvariae and femora of neonatal and adult C57BL/6-mice and performed RRBS with Msp1, a special protocol to enrich CpG islands first described by ZD Smith. After an optimization of the protocol neonatal and adult calvariae were successfully sequenced with the Illumina GAIIx. We have identified 605 differentially methylated regions (DMRs), of which 166 could be aligned to a gene. 9 DMRs were located in promotor regions -Cdh1, Zfhx3, Cct8l1, Il11, Fgfrl1, Shroom4, Shc2, Pstpip1 and Acn9. Cdh1, Zfhx3, Cct8l1, Il11 and Fgfrl1 are hypermethylated in the neonatal; Shroom4, Shc2 , Pstpip1 and Acn9 in the adult samples. E-Cadherin, Zfhx3, Fgfrl1 and Il11 have a previously described role in bone (re)modelling and development. Our result suggest a regulation of these genes by DNA promotor methylation. We also presume a role in bone metabolism of Cct8l1, Shroom4, Shc2 , Pstpip1 and Acn9 and a regulation by DNA methylation. Alternate genes that are involved in bone metabolism and development have DMRs in exonic and intronic regions and were further investigated. Therefore we treated cells of the cell line MC3T3-E1 subclone4 and pCOBs with different concentrations of 5-azacytidine in cell culture to cause a demethylation. Subsequent expression analysis by qPCR were performed to explore associations between methylation level and expression. We didn't find any associations between DNA methylation of intronic and exonic regions and expression. Previous investigations in other tissues match with our results. Our expression analysis during the differentiation of osteoblasts in cell culture showed a significant increase of Bmp8 und rPhex. Anyhow these genes doesn't seem to be regulated by DNA methylation. A validation of our results by "`Ultradeep-Bisulfite-Sequencing"' couldn't be successfully established. Primer annealing -the first step of the Bisulfit-PCR- was not feasible.