β3R3-Peptides - Peptidomimetic Foldamers for Biomedical Applications: Design, Structure and Activity

Abstract

β-peptides are one of the most explored peptidomimetic structures and are based on the introduction of an additional CH2-group within the peptidic backbone. In comparison to their natural counterparts, the β-peptides, they exhibit similar biological activity but overcome the limited stability and risk of cytotoxicity and immunogenicity and thus have a great potential for various biomedical applications. However, β-peptides are still limited in their structural space as so far they mainly form helical conformations. Thus, in order to fully explore the potential of β-peptides as peptidomimetics, an extension towards strand conformations and sheet structures as well as an optimization of their biological activity and reduction of their hemolytic effect is required. Therefore this thesis presents a novel class of peptidomimetics, the β3R3-peptides, with the goal to access strand and sheet conformations as well as to evaluate their potential as novel peptidomimetic agents for biomedical applications. More specifically, β3R3-peptides are based on alternating directions of the amide bonds along β-peptide sequences and have been designed to combine intrinsic physicochemical properties of α- and β- peptides. On the one hand, as for β-peptides, Cβ homologation can promote the formation of secondary structures along with improved proteolytic stability. On the other hand, the novel qualities of the backbone with alternating direction of the amide bonds are expected to extensively modulate both the structural and biological properties of classical β-peptide. The synthetic strategy towards this new class of peptidomimetics is based on solid phase synthesis using tailor-made building blocks. Initial focus of this work was devoted to the development of a versatile and efficient route for the synthesis of a set of chiral β-diamine building blocks with proteinaceous side chains. In addition, novel diacid building blocks were prepared either via asymmetric synthesis with chiral auxiliary or selected from the pool of commercially available chiral β-diacids with bioactive side chains (e.g. aspartic acid and malic acid). Moreover, diamine and diacid building blocks were coupled in solution to provide dimer building blocks suitable for conventional Fmoc solid phase peptide synthesis protocols. Conclusively, the synthetic protocols fulfill the requirements for the synthesis of building blocks suitable for solid phase synthesis, giving high yield and purity on multigram scale and relying exclusively on convenient purification methods. These building blocks were then applied to a standard peptide synthesizer for the fully automated synthesis of designed sets of oligomers with different physicochemical features and specific biomedical application - hydrophobic and amphiphilic cationic β3R3-peptides. Structural characterization showed that the β3R3-peptides with hydrophobic proteinaceous side chains are able to form strand conformations and sheet assemblies with different crystallinity at the air/water interface and thus extend the structural and functional space of β-peptides. Furthermore β3R3-peptides exhibit a high proteolytic stability making them an interesting new class of peptidomimetics for biomedical applications such as modulators/inhibitors of hydrophobic β-sheet formation or recognition, which has been proposed as a viable therapeutic strategy e.g. against Alzheimer’s disease. As a second class of β3R3-peptides, amphiphilic cationic β3R3-peptides were investigated as antimicrobial peptidomimetics. Designed oligomers showed highly selective antibacterial activity and a striking correlation between building block features, primary sequences, overall physicochemical properties and biological activity. Thus these systems are highly suitable for the development of novel antibacterial agents with high therapeutic index, as defined by the ratio between amounts of a therapeutic agent resulting a therapeutic effect and those amounts resulting toxicity. Lastly, rhodamine B conjugates of the amphiphilic cationic β3R3-peptides were carachterized as cell penetrating agents showing very high specific cellular uptake into HeLa, MDCKII and A10 cells. Furthermore they showed significantly increased and sequence based tunable protease stability. Thus these systems are highly suitable for the development as a new class of cell penetrating peptidomimetics for drug delivery. Overall, the synthesis of a novel class of peptidomimetics, the β3R3 peptides, was developed based on the solid phase coupling of tailor-made building blocks. The obtained systems have shown specific structural and biological properties and thus a high potential for biomedical applications such as β-strand mimetics as well as antimicrobial and cell penetrating agents. β3R3-peptides provide a potential tool to address a variety of biomedical issues and overcome current limitations of both natural α-peptides as well as other peptidomimetics.

β-Peptide sind eine der meist untersuchten peptidomimetischen Strukturen und basieren auf einer zusätzlichen CH2-Gruppe innerhalb des peptidischen Rückgrats. Im Vergleich zu ihrem natürlichen Vorbild, den α-Peptiden, besitzen sie eine ähnliche biologische Aktivität, sind aber stabiler und haben eine geringere Zytotoxizität und Immunogenizität. Daher besitzen solche Peptidomimetika ein großes Potential für verschiedene biomedizinische Anwendungen. Allerdings sind β-Peptide bisher in ihrer strukturellen Vielfalt begrenzt, da sie zumeist helikale Strukturen ausbilden. Um das volle Potenzial von β-Peptiden als Peptidomimetika zu nutzen, ist es notwendig, auch andere Konformationen wie etwa Faltblattstrukturen zugänglich zu machen. Darüber hinaus ist eine Optimierung der biologischen Aktivität bei gleichzeitiger Reduzierung der hämolytischen Wirkung ein wichtiges Ziel zur Weiterentwicklung von Wirkstoffen auf Basis von Peptidomimetika. Aus diesem Grund befasst sich diese Arbeitmit der Entwicklung einer neuen Klasse von Peptidomimetika, der sogenannten β3R3-Peptide. Ziel ist es, zum einen Strang- und Faltblattkonformationen zu ermöglichen, und zum anderen das Potential dieser neuen Peptidomimetika für verschiedene biomedizinische Anwendungen zu erforschen. Die β3R3-Peptide basieren auf der alternierenden Austrichtung der Amidbindungen in Kombination klassischen β-Peptidsequenz und kombinieren so die intrinsischen physikochemischen Eigenschaften von α- und β-Peptiden. Auf der einen Seite ermöglich dies, wie auch bei den klassischen ß-Peptiden, die Ausbildung von Sekundärstrukturen und gleichzeitig eine verbesserte proteolytische Stabilität. Auf der anderen Seite kann die Neuorientierung der Amidgruppen entlang des Rückgrats nun zu einer Erweiterung der möglichen Strukturbildung und somit auch zu neuen, verbesserten biologischen Eigenschaften führen. Die Synthese der β3R3-Peptide basiert auf der Festphasensynthese und Verwendung maßgeschneiderter Bausteine. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich daher mitder Entwicklung einer schnellen und effizienten Syntheseroute für ein erstes Alphabet von chiralen β Diaminbausteinen mit proteinogenen Seitenketten. Des Weiteren wurden neue Disäure Bausteine hergestellt, einerseits durch asymmetische Synthese mit chiralen Auxiliaren, andererseits durch die Verwendung von käuflich erhältlichen, chiralen β-Disäuren (z.B. Asparaginsäure und Maleinsäure). Zudem wurden Diamin- und Disäurebausteine in Lösung gekuppelt, um so Dimer-Bausteine zu erhalten, welche für die Standard-Fmoc-Peptidfestphasensynthese (SPPS) verwendet werden können. Die erhaltenen Bausteine wurden dann in vollautomatisierten Synthesen an einem Standard-Peptidsynthesizer eingesetzt und so verschiedene Oligomere mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften erhalten. Im Speziellen wurden hierbei zwei Klassen von Oligomeren synthetisiert: hydrophobe und amphiphil-kationische β3R3-Peptide. Die strukturelle Charakterisierung zeigte, dass β3R3-Peptide mit hydrophoben proteinogenen Seitenketten Strang- und Faltblatt-Konformationen ausbilden können, die unterschiedliche Kristalllinität an der Wasser/Luft Grenzfläche aufweisen und dadurch den funktionellen und strukturellen Rahmen von β-Peptiden erweitern. Außerdem weisen die β3R3 Peptide hohe proteolytische Stabilität auf, was sie zu einer interessanten neuen Klasse von Peptidomimetika für biomedizinische Anwendungen macht, etwa als Modulatoren/Inhibitoren von hydrophoben β-Faltblatt Strukturen und somit möglicherweise als Therapie gegen Alzheimer. Zweitens wurden amphiphile kationische β3R3 Peptide als antimikrobielle Peptidomimetika untersucht. Speziell ausgewählte Oligomersequenzen zeigten hohe Selektivität gegen Bakterien und eine herausragende Übereinstimmung zwischen Wahl der Bausteine, Primärstruktur, physikochemischen Eigenschaften und biologischer Aktivität. Diese Systeme sind gut geeignet für die Entwicklung von neuen antibakteriellen Wirkstoffen mit hohem therapeutischem Index, also einer hohen biologischen Aktivität bei gleichzeitig geringer Toxizität. Zusätzlich wurden Rhodamin-B Konjugate der amphiphilen kationischen β3R3 Peptide hergestellt und als Zell- durchdringende Wirkstoffe charakterisiert. Alle untersuchten Oligomere zeigten eine hohe spezifische Aufnahme in HeLa, MDCKII und A10 Zellen und wiesen abhängig von ihrer Sequenz eine erhöhte Stabilität gegenüber Protease auf. Somit sind diese Strukturen gut geeignet für die Weiterentwicklung als neue Klasse Zell-durchdingender Peptidomimetika und besitzen ein großes Potential für Anwendungen im Bereich des Wirkstofftransports. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine neue Klasse von Peptidomimetika entwickelt, die β3R3 Peptide, basierend auf der Festphasenkupplung von maßgeschneiderten Bausteinen. Die erhaltenen Strukturen zeigten spezifische strukturelle und biologische Eigenschaften und besitzen somit ein großes Potential für verschiedene biomedizinische Anwendungen etwa als β-Faltblatt-Mimetika oder Zell durchdingende und antimikrobielle Wirkstoffe. Insgesamt stellen die β3R3 Peptide also eine neue Klasse der Peptidomimetika dar, die die Einschränkungen der bisher untersuchten α-Peptide und Peptidmimetika überwinden und somit breite Anwendung in der Biomedizin aber auch Biotechnologie und den Materialwissenschaften finden können.