Verwendung von synthetischen NLS-Sequenzen für den nicht-viralen Gentransfer in humane Tumoren

Abstract

Der Transfer von exogener DNA in den Zellkern ist ein ineffizienter Prozess und gilt als wesentlichen limitierenden Faktor für nicht-virale Gentransfersysteme. Eine Strategie besteht in der Verwendung von peptidischen Kernlokalisationssignalen (NLS), um durch Nutzung von zellulären Transportmechanismen den Kernimport von Plasmid-DNA zu erleichtern. Inhalt der vorliegenden Arbeit ist die Rolle von synthetischen NLS-Peptiden in DNA- Komplexen während des Transfektionsvorgangs. Dazu wurden unterschiedliche Peptide konstruiert, die jeweils eine NLS-Sequenz viralen Ursprungs enthalten und zusätzlich an einer Oligolysin-DNA-Bindungsdomäne fusioniert sind. Die resultierenden Peptid/DNA-Komplexe wurden in in vitro-Tranfektionsversuchen mit humanen Tumorzellen eingesetzt und führten zu einer NLS- sequenzspezifischen 1.5-2.5-fachen Erhöhung der Reportergenexpression. Die Transfektionseffizienz hing sowohl von der NLS-Sequenz als auch von dem eingesetzten Peptid/DNA-Ladungsverhältnis ab. Um ein besseres Verständnis über den Transfektionsvorgang zu erlangen, wurden die physikochemischen Eigenschaften der Peptid/DNA-Komplexe näher untersucht und mit der Transfektionseffizienz verglichen. Die NLS-Sequenz hatte einen Einfluss auf den Kondensierungsgrad der DNA, das Zeta-Potential und das Aggregationsverhalten der resultierenden Komplexe. Mit HCT 116-Zellen wurde die Transfektionseffizienz im wesentlichen von der Größe und Kompaktheit der Komplexe bestimmt. Transmissionelektronenmikroskopische Untersuchungen von transfizierten Zellen zeigten zudem die Internalisierung von Mikrometer-großen Aggregaten und bestätigten das Ergebnis der physikochemischen Untersuchung. Somit wurde ein unspezifischer, aber sequenzabhängiger Effekt des NLS-Peptids auf den Gentransferprozess nachgewiesen. Eine nähere Analyse der Daten deuten auf unspezifische Wechselwirkungen innerhalb des Komplexes aufgrund der Aminosäurenzusammensetzung des Peptids. Auswirkungen dieses Ergebnisses auf den Optimierungsprozess von nicht-viralen Multikomponentensysteme wurden diskutiert. Insbesondere bedeutete die Aggregation eine weitere Hürde für eine in vivo-Applikation des Systems im Hinblick einer gentherapeutischen Anwendung. Die kolloidale Stabilisierung von DNA-Komplexen war daher ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit. Aufbauend auf jüngste Entwicklungen im Bereich der Nanobiotechnologie wurde versucht, eine Beschichtungstechnik aufbauend auf die schrittweise Adsorption von entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten zur elektrostatischen Stabilisierung der DNA-Komplexe anzuwenden. Als Modellsystem wurde zunächst mit Polyethylenimin- vorkondensierte Plasmid-DNA unter salzfreien Bedingungen mit den synthetischen Polyanionen Polyvinylsulfat (PVS) bzw. Polystyrensulfonat (PSS) kombiniert. Als Ergebnis wurden erstmals stark negativ geladene DNA-Nanopartikel generiert, die unter physiologischen Salzbedingungen kolloidal stabil waren. Darüber hinaus führte die direkte Injektion der Partikel in Transplantationstumore von Nude-Mäusen zu relativ hohen Reportergenexpressionen ohne Anzeichen auf Toxizität. Dieses Ergebnis ist daher ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von nicht-viralen Gentransfersystemen zu Virus-ähnlichen Partikeln. Im nächsten Schritt wurden NLS-Peptide eingebaut. Mit dem PVS wurden etwa 100 nm-große, kolloidal stabile Partikel generiert, die in Abhängigkeit des Peptids und des eingesetzten Ladungsverhältnisses ein Zeta-Potential von - 42 mV bis - 62 mV aufwiesen. In vitro-Transfektionsversuche zeigten mit diesen Nanopartikeln keine messbare Reportergenexpression, was mit anderen publizierten Untersuchungen mit negativ geladenen Komplexen übereinstimmt. Da eine in vivo-Applikation den Einbau von zusätzlichen funktionellen Komponenten voraussetzt, wurde danach der Bildungsmechanismus der Nanopartikel durch physiko-chemische und morphologische Untersuchungen näher charakterisiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß das PVS den Peptid/DNA-Komplex durchdrang und entgegen dem ursprünglichen Modell zur Generierung von durchmischten Partikeln führte. Ein weiteres wichtiges Resultat war die starke beobachtete Empfindlichkeit der DNA-Nanopartikel gegenüber Schwankungen der Salzkonzentration. Dies wurde auf den besonderen Einfluss der Ionenstärke sowohl auf elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den Polyelektrolyten als auch auf die Flexibilität der DNA zurückgeführt. Als Folge wurde schließlich das Herstellungsverfahren auf physiologische Salzbedingungen angepasst. Dies gelang mit dem PSS als Polyanion durch eine drastische Erhöhung des Peptid/DNA-Ladungsverhältnisses von 3.0 auf 20 und eine zusätzliche Erhöhung des Polyanion/DNA- Gewichtsverhältnisses von 1.2 auf 50. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse auf einem strukturierten Aufbau der Partikel bestehend aus einem Peptid/DNA-Kern, der von einer negativ geladenen PSS-Hülle umgeben ist. Somit wurde eine für die Entwicklung mehrschichtiger Virus-ähnlicher Nanopartikel für den in vivo- Gentransfer wichtige Grundlage geschaffen.

The transfer of exogenous DNA into the nucleus is an inefficient process and is considered as a major limiting step for the nonviral gene delivery. One of the strategies to improve nuclear uptake of DNA is taking advantage of the cellular nuclear import machinerie by coupling a peptide bearing a nuclear localization signal (NLS) to the DNA. The aim of the present work is to analyse the role of synthetic NLS-peptides non covalently bound to DNA- complexes during the transfection process. Peptides containing a virus derived NLS-sequence fused to an oligolysin-DNA-bindung domain were designed. Subsequently, peptide/DNA-complexes were generated and used to transfect human tumor cells in vitro. The result showed a 1.5 to 2.5-fold NLS-sequence specific increase of reporter gene expression. The transfection efficiency was related both to the used NLS-sequence and the employed peptide to DNA charge ratio. In order to gain an insight into the transfection process the physicochemical properties of peptide/DNA-complexes were examined and compared to the transfection efficiency. As a result, the NLS-sequence was shown to influence the DNA condensation rate, the Zeta-potential as well as the aggregation behavior of the resulting DNA-complexes. The transfection efficiency was mainly determined by the size and the compaction rate of the complexes. Moreover, transmission electron microscopy observations showed the effective internalization of micrometer-sized aggregates, thus confirming the physicochemial study. Therefore, this result demonstrates an unspecific effect of the NLS-peptide on the gene transfer process. However, this effect strongly depended on the particular NLS-sequence. A more thorough analysis of the data was performed and suggests the occurence of unspecific interactions within the DNA-complex due to the particular amino acid composition of the peptide. This has strong implications for the optimization of nonviral multicomponent systems which was also discussed. In particular, the aggregation tendency represents an additional hurdle for the in vivo-application in the frame of human gene therapy. As a consequence, the ability to generate colloidal stable DNA-complexes became a major issue of the present work. A potential solution arose from recent advances in the field of nanobiotechnology. The layer-by- layer technique consists in the stepwise deposition of oppositely charged polyelectrolytes resulting in the formation of well defined multilayers systems. Therefore, the aim was to use this technique in order to achieve stabilization of DNA-complexes by electrostatic repulsion. As a model system, preformed polyethyleneimine/plasmid-DNA-complexes were combinded to the synthetic polyanions polyvinyl sulfate (PVS) or polystyrene sulfonate (PSS) under salt-free conditions. The results showed the generation of negatively charged DNA-nanoparticles which were colloidal stable in physiological salt conditions. Moreover, intratumoral injection of particles into transplantation tumors of nude mice resulted in relatively high reporter gene expression without apparent toxicity. Therefore, this result represents a significant advance in the development of DNA-containing nanoparticles for nonviral gene delivery. The following step was the incorporation of NLS-peptides. Using PVS as the polyanion, 100 nm-sized colloidal stable particles were generated. A Zeta-potential lying between - 42 mV and - 62 mV was measured depending on the incorporated peptide. Following in vitro-transfection, no significant reporter gene expression could be found. This is in agreement with other published studies using negatively charged particles. The in vivo delivery of the particles would require the incorporation of additional functional elements. Therefore, the nano-particle formation process was investigated using physicochemical and morphological approaches. The results showed a penetration of the PVS into the peptide/DNA-complex leading to the generation of scrambled interpolyelectrolyte complexes. This was in contradiction to the original model of a core-shell-structure of the particle. Additionally, the DNA- containing particles showed a strong sensitivity regarding variations in the salt concentration. This was attributed to the influence of the ionic strength to electrostatic interactions between the polyelectrolytes as well as to the flexibility of the DNA molecule. Consequently, the entire particle formation procedure was adapted to physiological salt conditions. Using PSS as the polyanion, this was achieved following a dramatic increase of the peptide to DNA charge ratio from 3.0 to 20 and the subsequent increase of the PSS to DNA weight ratio from 1.2 to 50. Moreover, these results suggest a structured assembly of the particle consisting in a peptide/DNA-core surrounded by a PSS- shell. As a consequence, this work may provide a basis for the development of multilayered virus-like particles for nonviral gene delivery.