dc.contributor.author
Stock, Nina K.
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:59:13Z
dc.date.available
2014-07-18T11:57:50.970Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1893
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-6095
dc.description.abstract
Das Gelbfiebervirus (GFV) stellt trotz des Vorhandenseins eines effektiven
Impfstoffes nach wie vor ein weltweites, ernstzunehmendes Gesundheitsproblem
dar. Molekularepidemiologische Analysen von Gelbfieberviren sind aufgrund der
begrenzten Verfügbarkeit von Sequenzdaten bisher nur eingeschränkt möglich.
Innerhalb dieser Arbeit wurde das Genom von drei GFV-Impfstämmen und 14
westafrikanischen Wildisolaten erstmals vollständig sequenziert und
veröffentlicht. Damit wurde die Anzahl frei verfügbarer GFV-Genomsequenzen von
ursprünglich 21 auf 38 erhöht. Mit Hilfe dieser Sequenzdaten wurden
anschließend die Verwandtschaftsbeziehungen von Gelbfieberviren unter
separater Betrachtung von Impfstämmen und Wildtypstämmen eingehend analysiert.
Die Analyse der Impfstämme beinhaltet einen umfassenden Sequenzvergleich, die
Generierung eines phylogenetischen Stammbaumes basierend auf Genomsequenzen
sowie dessen Vergleich mit der historischen Genealogie von GFV-Impfstoffen.
Damit wurde der beim letzten WHO-Meeting zu GFV-Impfstoffen angesprochenen
Notwendigkeit einer molekularbiologischen Datenanalyse entsprochen und somit
erstmalig die Möglichkeit geschaffen, die molekularen Abstammungsmerkmale mit
den Daten der historischen Aufzeichnung direkt zu vergleichen. Durch diese
Arbeit wird die zukünftige Forschung zu GFV-basierten Impfstoffen wesentlich
erleichtert. Die Untersuchung westafrikanischer GFV-Isolate umfasst zusätzlich
zu einer Sequenzanalyse und der Generierung eines phylogenetischen Stammbaumes
die Untersuchung biologischer Eigenschaften. Die auf GFV-Gesamtgenomsequenzen
basierenden Stammbaumanalysen konnten eine vorausgegangene, auf partiellen
Sequenzdaten basierende Klassifizierung westafrikanischer Genotypen in sechs
verschiedene GFV-Linien bestätigen und fünf bisher nicht charakterisierte GFV-
Isolate in diese Klassifizierung einbeziehen. Diese Untersuchung unterstreicht
außerdem die Notwendigkeit einer verstärkten und kontinuierlichen Erhebung von
Sequenzdaten afrikanischer GFV-Isolate, um so die Möglichkeiten
epidemiologischer und evolutionsbiologischer Studien zum GFV zu erweitern. Die
Replikation der westafrikanischen GFV-Linien (Moskitoisolate) wurde in humanen
Leberzellen und Insektenzellen vergleichend zu der der Referenzstämme Asibi
und 17D (Humanisolate) untersucht. Insgesamt weisen die Gruppen der
Moskitoisolate und der Referenzstämme in beiden Zelllinien deutliche
Unterschiede zueinander im Wachstumsverhalten auf, was eine vorausgegangene
Zelladaption implizieren könnte. Die Wachstumsanalysen der westafrikanischen
GFV-Linie 3 zeigen abweichende Ergebnisse zu beiden Gruppen (Moskito- und
Humanisolate). Auffällig ist zudem ein gehäuftes Auftreten von Mutationen in
der Proteinsequenz dieser Linie, die in keiner anderen Linie zu finden sind.
Vor dem Hintergrund, dass diese Linie bisher als einzige in einem natürlichen
Kontext mit vertikaler Transmission in Verbindung gebracht werden konnte, wäre
eine weitere Charakterisierung dieses Isolates sowohl zur Aufklärung
bestimmter Proteinfunktionen als auch zum Verständnis der vertikalen
Transmission sehr wichtig. Die hier durchgeführte Studie verbindet erstmals
genetische Informationen mit phänotypischen Eigenschaften afrikanischer GFV-
Wildisolate und diskutiert bestehende Wissenslücken im Bereich der Funktion
und Ökologie von Gelbfieberviren. Sowohl für Forschungszwecke als auch für die
Diagnostik einer akuten GFV-Infektion besteht ein großer Bedarf an neuen
Testsystemen für den gezielten Nachweis einzelner Virusproteine. Zur
Entwicklung neuer Nachweismethoden wurden in dieser Arbeit polyklonale
Peptidantiseren gegen die GFV-Proteine E, C und NS1 hergestellt und
charakterisiert. Die Antiseren gegen die Proteine C und NS1 weisen in
verschiedenen Methoden gute Ergebnisse für eine spezifische Proteindetektion
auf. Innerhalb dieser Arbeit konnten diese Seren bereits zur Untersuchung der
GFV-Proteinexpression während einer Infektion im Zellkultursystem angewandt
werden und erweitern damit die Möglichkeiten in der Forschung. Durch die
Sezernierung ins Blut während der frühen Infektionsphase im Menschen stellt
das NS1-Protein ein geeignetes Zielprotein für die GFV-Diagnostik dar. Das
hier hergestellte NS1-Antiserum ist daher zusätzlich ein vielversprechendes
Tool zur Entwicklung neuer diagnostischer Methoden. Die Etablierung eines
ELISA-Tests für den spezifischen Nachweis von GFV-Proteinen konnte innerhalb
dieser Arbeit nicht abgeschlossen werden. Die bisher erhaltenen Ergebnisse
liefern jedoch eine Basis für die zukünftige Weiterentwicklung dieser Methode.
Im Rahmen der Entwicklung neuer Methoden zur Untersuchung der GFV-Pathogenese
wurde in dieser Arbeit außerdem ein Konzept zur Herstellung
fluoreszenzmarkierter GFV-Partikel für eine Anwendung in
Lebendzellexperimenten entwickelt. Insgesamt wurden vier gentechnisch
veränderte GFV hergestellt, die jeweils eine kurze Peptidsequenz für eine
spezifische Fluoreszenzmarkierung in unterschiedlichen Proteinbereichen
enthalten. Eines dieser Konstrukte ist in der Lage, infektiöse virale Partikel
zu bilden. Die erzielten Ergebnisse bieten eine Grundlage für die
Weiterentwicklung und Anwendung dieser neuartigen Methode. Insgesamt erweitert
diese Arbeit das Methodenspektrum zur Untersuchung und Diagnostik von
Gelbfieberviren.
de
dc.description.abstract
Despite the availability and effectiveness of the live attenuated vaccine 17D,
yellow fever virus (YFV) remains a serious public health problem worldwide.
However, due to limited accessibility of sequence data, the possibilities for
molecular epidemiological analyses of YFV are still restricted. Within this
work, the whole genomes of three YFV vaccine strains and 14 West African wild
isolates have been sequenced for the first time, thus increasing the number of
published YFV whole genome sequences from 21 to 38. Using this sequence data,
the phylogenetic relationships of yellow fever viruses were extensively
analyzed, considering vaccine and wild-type strains separately. The analyses
of vaccine strains include a comprehensive comparison of YFV sequences, the
generation of a phylogenetic tree based on full genome sequences and its
comparison with the historical genealogy of YFV vaccines. This investigation
responds to the need for a molecular data analysis of vaccine strains, which
was addressed during the WHO meeting for the evaluation of yellow fever
vaccines in 2009. For the first time the present study enables researchers to
relate directly the genealogy of vaccine strains with the corresponding
molecular data and provides valuable information for the prospective research
on YFV-based vaccines. The investigation of West African YFV isolates includes
the analysis of sequence data, the generation of a phylogenetic tree as well
as the investigation of biological strain characteristics. The phylogenetic
analyses based on full genome sequences support a classification of West
African genotypes into six distinct YFV lineages which had been identified
previously by partial sequence analyses. Five formerly uncharacterized YFV
isolates were integrated into this classification for the first time.
Furthermore, this investigation underlines the need for intensified and
continuous acquisition of sequence data from YFV wild-type strains, in order
to promote future epidemiological and evolutionary biological studies. The
replication of the West African YFV lineages (mosquito isolates) has been
investigated in human liver cells and insect cells, in comparison to the YFV
reference strains Asibi and 17D (human isolates). Overall, the mosquito
isolates and the reference strains disclose clear differences regarding their
growth behavior in both cell lines, potentially implicating previous cell
adaptation. YFV lineage 3 exhibits deviating growth characteristics compared
to both groups of YFV strains (mosquito and human isolates). In addition, its
protein sequence reveals a conspicuous accumulation of unique mutations which
could not be found in other lineages. Against the background that so far this
lineage has been the only one which could be isolated in the context of
vertical transmission in nature, further characterization of this isolate
would be of great interest for the understanding of certain protein functions
and vertical transmission. The presented study combines for the first time
genetic information with phenotypical characteristics of African YFV wild-type
isolates and discusses existing gaps of knowledge in the field of character
and ecology of yellow fever viruses. To date, there is still a need for new
test systems detecting specific viral proteins for the diagnostics of acute
YFV infections as well as for research purposes. For this purpose, polyclonal
peptide antisera for the detection of YFV proteins E, C and NS1 were produced
and characterized as part of this study. The antisera against the C and NS1
protein showed positive results for the specific detection of the target
protein in various tests and were used to investigate the protein expression
during YFV infection in cell culture. The usage of these antisera extends the
possibilities for research applications. Due to its secretion into the blood
during the early stages of infection in humans, the NS1 protein represents a
suitable target for YFV diagnostics. Therefore, the NS1 antiserum produced in
this study represents a promising tool for the development of novel diagnostic
tests. The establishment of an ELISA test for the specific detection of YFV
proteins could not be completed during this study. However, the preliminary
results provide a basis for further development and application of this
method. With the aim to develop new methods for the investigation of YFV
pathogenesis, a concept for the construction of fluorescence-labeled YFV
particles suitable for live cell experiments has been initiated and developed
as part of this study. Overall, four genetically modified YFV constructs were
produced, carrying a small peptide sequence for fluorescence labeling at
different insertion sites. One YFV construct is able to create infectious
viral particles and offers the basic principle for the advancement and
application of this novel method. Together, the results of this study enlarge
the methodological spectrum for the investigation and diagnostics of yellow
fever virus.
en
dc.format.extent
V, 187 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
yellow fever virus
dc.subject
peptide antibodies
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Molekularepidemiologische Analysen von Gelbfiebervirusisolaten und Entwicklung
neuer Nachweismethoden zur Untersuchung und Diagnostik von Gelbfieberviren
dc.contributor.contact
nina.stock@web.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Matthias Niedrig
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.date.accepted
2014-04-28
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000097129-3
dc.title.translated
Molecular epidemiological analyses of yellow fever virus isolates and
development of new tools for the diagnostic and research of yellow fever virus
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000097129
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000015518
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open access