Barrierefunktion der Claudine des dicken aufsteigenden Astes der Henle- Schleife

Abstract

Die Tight Junction (TJ) ist eine supramolekulare Struktur aus Membranproteinen und deren intrazellulären Adapterproteinen. Sie gestaltet den Zellzwischenraum und reguliert damit die parazelluläre Permeabilität eines Epithels. Die Claudine, eine Familie von TJ-Proteinen, durchspannen die Zellmembran viermal und bilden zwei extrazelluläre Schleifen. Die Claudin-Zusammensetzung der TJs bestimmt die Permeabilität des Epithels. Einige Claudine sind spezifisch für bestimmte Gewebe. Andere kommen in vielen verschiedenen Geweben vor und ermöglichen durch ihre Interaktion untereinander die für dieses Gewebe spezifische TJ-Struktur und -Durchlässigkeit. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der elektrophysiologischen Charakterisierung der Claudine des dicken aufsteigenden Astes der Henle-Schleife. Dieses Nephronsegment ist vor allem wichtig für die Resorption anorganischer Ionen und spielt dadurch eine herausragende Rolle in der Regulation der Körperflüssigkeiten, insbesondere der Kontrolle des Blutdruckes. Methoden Die murinen (m) oder humanen (h) Claudine 10, 11, 16 und 19 wurden stabil in hochohmige MDCK C7-Zellen (Madin-Darby Canin Kidney) transfiziert. Neben den Wildtyp-Proteinen interessierten besonders die in Mäusen und Menschen vorkommende Proteine der Spleiß-varianten und Mutanten. Leervektor-transfizierte Zellen dienten als Kontrollzellen. Die Transfektionskontrolle erfolgte mittels Westernblot und RNA-Nachweis. Immunhistochemische Färbungen dienten der Klärung der Lokalisation. Die Zellklone, bei denen die transfizierten Claudine in der TJ nachgewiesen werden konnten, wurden in Ussing-Kammern auf ihre elektrophysiologische Funktion hin untersucht. Dabei fokussierten wir uns auf die monovalenten (Lithium, Natrium, Kalium, Rubidium und Caesium) und divalenten Kationen (Calcium, Magnesium, Strontium, Barium). Die Berechnung der Permeabilitätsverhältnisse und der absoluten Permeabilitäten erfolgte mittels einer modifizierten Goldman-Hodkin-Katz-Gleichung. Ergebnisse Die konfokale Laserscanningmikroskopie zeigte die überexprimierten Claudine kolokalisiert mit Occludin, einem TJ-Marker. Exprimierten die MDCK C7-Zellen Claudin-10 Variante 1 kam es zu keiner Veränderung der Permeabilität für mono- und divalente Kationen. Exprimierten die Zellen hingegen die Variante 2 des Claudin-10 konnte eine signifikante Erniedrigung des Widerstandes und eine starke Erhöhung der Permeabilität aufgezeigt werden. Besonders interessant ist die Verschiebung der Permeabilitätssequenz für monovalente Kationen der Claudin-10 Variante 2-Klone von der Eisenman-Sequenz IV der Kontrollzellen zur Sequenz X. Die Eisenman-Sequenz IV spiegelt eine schwächere, die Sequenz X eine stärkere Interaktion zwischen dem durchtretenden Ion und der TJ wieder. Die Anwesenheit von Claudin-10 V.2 führt wahrscheinlich zu der Bildung einer Kation-selektiven Pore. Die Kokultur der Claudin-10 Varianten hingegen wies ein Verlust der Selektivität auf. Die Permeabilitätssequenz verschob sich hin zu einer schwächeren Interaktion im Vergleich zu den Kontrollzellen (Eisenman- Sequenz I). Diese Veränderung wird wahrscheinlich durch eine Interaktion der Claudinvarianten hervorgerufen. Diskussion Der dicke aufsteigende Ast der Henle-Schleife hat zwei Hauptaufgaben: die Resorption von Kationen und die Bildung eines osmotischen Gradienten zur Regulation der Wasserresorption in den folgenden Abschnitten. Das durch den aktiven Transport von Natrium-, Kalium- und Chloridionen geschaffene lumenpositive Potential dient als Triebkraft für die passive Kationenresorption entlang der TJ. Dieses lumenpositive Potential wird durch die hohe Natriumpermeabilität in Gegenwart des Claudin-10 V.2 verstärkt. Das führt zu einem Anstieg der Triebkraft für die parazelluläre Resorption besonders von Calcium- und Magnesiumionen. Die Permeabilitäten für diese divalenten Ionen sind in Gegenwart des Claudin-10 V.2 ebenfalls erhöht. Damit scheint Claudin-10 V.2 neben Claudin-16 und -19 als ein weiteres Mitglied der Claudin-Familie eine wichtige Rolle für die Resorption von divalenten Ionen einnehmen.

The Tight Junction (TJ) is a supramolecular structure consisting of various membrane proteins and their intracellular adapter proteins. It forms the inter-cellular space and thereby regulates the paracellular permeability of epithelia. Claudins, a family of TJ proteins, span the cell membrane four times and form two extracellular loops. They can serve as paracellular barrier, but may also carry out a specific channel function. Some claudins are specific to a particular tissue. Others are found in many different tissues and define the TJ structure and permeability specific to this type of tissue via an interaction with other claudins. The present work deals with the electrophysiological characterisation of the claudins of the thick ascending limb of Henle’s loop. This nephron segment is particularly important for the reabsorption of ions and thus plays an important role in the homeostasis of the ionic concentrations and of the blood pressure in the human body. To this end, murine (m) or humane (h) claudins 10, 11, 16, and 19 were stably transfected into high-resistance MDCK-C7 cells (Madin-Darby Canin Kidney). In addition to the wildtype proteins, the focus of interest was in particular on the splice variants and mutant proteins found in mice and humans. Vector-only transfected cells were used as control cells. Transfection success was controlled via western blot analysis and RNA-isolation. Immunohistochemical stainings were used to clarify the cellular localization. Electrophysiological function was examined in Ussing chambers in cell clones with tight-junctional localization of the transfected claudins. Transepithelial electric resistance was measured and ion selectivity was analysed using dilution and bi-ionic potentials, focussing on monovalent (lithium, sodium, potassium, rubidium and caesium) and divalent cations (calcium, magnesium, strontium, barium). Calculation of permeability ratios and absolute permeabilities was carried out using a modified Goldman-Hodgkin-Katz equation. Confocal laser scanning microscopy demonstrated that the overexpressed claudins were co-localised with occludin, a TJ marker. When MDCK-C7 cells expressed claudin-10 variant 1, there was no change in permeability for mono and divalent cations. In contrast, when the cells expressed variant 2 of claudin-10 (claudin-10 V.2), a significant reduction of resistance and a strong increase in permeability was found. Of particular interest is the shift of the permeability sequence for monovalent cations of claudin-10 V.2-clones from Eisenman sequence IV of the control cells to sequence X. Eisenman sequence IV reflects a weaker interaction, sequence X reflects a stronger interaction between the permeating ion and the TJ. The presence of claudin-10 V.2 presumably leads to the formation of a cation-selective pore. Co-culture of the claudin-10 variants, in contrast, showed a loss of selectivity. The permeability sequence shifted to a weaker interaction in comparison to the control cells (Eisenman sequence). This change is presumably due to an interaction between the claudin variants. The thick ascending limb of the loop of Henle has two main tasks: the reabsorption of cations and the formation of an osmotic gradient for the regulation of water reabsorption in the following sections. Cation reabsorption takes place via active and passive transport mechanisms. The lumen-positive potential generated by the active transport of sodium, potassium and chloride serves as a driving force for the passive cation reabsorption along the TJ. This lumen-positive potential is strengthened by the high sodium permeability in the presence of claudin-10 V.2. This leads to an increase in the driving force for the paracellular reabsorption, in particular of calcium and magnesium. The permeability for these divalent ions is also increased in the presence of claudin-10 V.2. In cooperation, claudin-16 and -19 appear to guarantee the reabsorption of divalent ions, especially magnesium. Thus, in addition to claudin-16 and -19, claudin-10 V.2 appears to play a key role for the reabsorption of divalent ions as a further member of the claudin family.