Synthese und Struktur-Wirkungsuntersuchungen von 2,4,5-Triaryl-2-imidazolinen

Abstract

In vorhergehenden Arbeiten konnten Imidazolinderivate mit interessanten pharmakologischen Eigenschaften synthetisiert werden, insbesondere (4R,5S)/(4S,5R)-2,4,5-Triaryl-2-imidazoline mit lipophilen Substituenten wie Methyl, Methoxy oder Chlor an den Aromaten in Position 2, 4 und 5 des Imidazolinringes. Diese Verbindungen weisen in Abhängigkeit vom Substitutionsmuster ausgeprägt zytotoxische Wirkungen an Krebszellen auf. Ziel dieser Arbeit war es neue Derivate der 2,4,5-Triaryl-2-imidazoline zu entwickeln und diese hinsichtlich ihrer Struktur-Wirkungsbeziehung zu analysieren. Die strukturellen Veränderungen wurden zum einen durch N-Alkylierung und N,N'-Dialkylierung und zum anderen durch Änderung der Konfiguration von (4R,5S)/(4S,5R) in (4R,5R)/(4S,5S) vorgenommen. Mit Hilfe der Mikrowellentechnologie konnten Synthesemethoden entwickelt werden, die schnell und effizient zu den angestrebten Zielstrukturen führten. Darüber hinaus wurden (4R,5S)/(4S,5R)-2,4,5-Triaryl-2-imidazoline mit stickstoffhaltigen Substituenten an den 2,4,5-positionierten Aromaten erfolgreich synthetisiert. Die erzielten Verbindungen wurden auf ihre zellulären Wirkungen getestet. Dazu wurde zuerst der Einfluss der Strukturvariationen der 2,4,5-Triaryl-2-imidazoline auf die Hemmung der Zellproliferation unter Verwendung der Tumorzelllinien: A549, MCF-7, MDA- MB-231 und U2OS untersucht. Dabei stellten sich die N,N'-dipropylierten 2-Imidazoline als die Verbindungen mit den stärksten zytotoxischen Eigenschaften von den im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten und getesteten Verbindungen heraus. Beispielsweise wurde für das (4R,5S)/(4S,5R)-N,N'-Dipropyl-2,4,5-tris(4-ethylphenyl)-2-imidazoliniumiodid an den MCF-7 Zellen ein IC50 Wert von 40 nmol/l ermittelt. Auch eine N-Alkylierung der 2,4,5-Triaryl-2-imidazoline führt zu einer Steigerung der Zytotoxizität. Die N-methyl- bzw. N-ethylierten 4-Chlor- und 4-Nitro- substituierten 2-Imidazoline erfuhren eine drastische Abschwächung der zytotoxischen Eigenschaften. Mit zunehmender Länge der N-Alkylkette und der damit verbundenen Erhöhung der Lipophilie nehmen die IC50 Werte im Allgemeinen deutlich ab. Die (4R,5S)/(4S,5R)-2,4,5-Triaryl-2-imidazoline mit stickstoffhaltigem Substitutionsmuster an den Aromaten weisen deutlich höhere IC50 Werte auf als die lipophileren Verbindungen. Ausgeprägte Unterschiede zwischen den (4R,5S)/(4S,5R)- und (4R,5R)/(4S,5S)-konfigurierten Verbindungen konnten nicht festgestellt werden. In weiterführenden biochemischen Untersuchungen wurden die hoch zytotoxisch wirkenden Verbindungen auf ihre Apoptose induzierenden Eigenschaften getestet. So konnten beispielsweise für die N,N'-Dimethyl-2,4,5-tris(4-ethylphenyl)-2-imidazoliniumiodide sowohl eine Caspase-3-Aktivität von etwa 2.5 als auch ein positiver Nachweis von ssDNA (Fx = 6.5-8.1) beobachtet werden. Für die dazugehörigen einfach alkylierten Verbindungen wurde lediglich Einzelstrang-DNA nachgewiesen (Fx = 7.5-7.9). Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit der 2,4,5-Triaryl-2-imidazoline mit Nutlin-3a wurde mit Hilfe eines zellulären Hdm2- und p53-Assays eine mögliche Inhibition des Hdm2-Proteins und dem damit verbundenen p53-vermittelten Zelltod untersucht. Die immunhistochemische Quantifizierung von p53 und Hdm2 ergab für die N-alkylierten und N,N'-dialkylierten (4R,5S)/(4S,5R)-2,4,5-Triaryl-2-imidazoline keine durch p53 initiierte Apoptose. Eine Hemmung von Hdm2 kann für das (4R,5S)/(4S,5R)-2,4,5-Tris(4-chlorphenyl)-2-imidazolin diskutiert werden, da in den Tumorzellen eine höhere Konzentration an Hdm2 als an p53 gefunden wurde. Des Weiteren stellte sich für die untersuchten (4R,5R)/(4S,5S)-2,4,5-Triaryl-2-imidazoline heraus, dass die Verbindungen weder in alkylierter noch in nicht alkylierter Form in der Lage sind p53 zu aktivieren. Die Testergebnisse der bisherigen Apoptose-Untersuchungen haben gezeigt, dass die 2,4,5 Triaryl-2 imidazoline durchaus in der Lage sind den programmierten Zelltod auszulösen. Dennoch scheint die Apoptose nicht über den p53-vermittelten Signalweg und in der ausführenden Phase nicht vornehmlich über die Effektorcaspase-3 zu verlaufen. Es sind daher zwingend weitere Untersuchungen nötig, um den Wirkungsmechanismus der äußerst potenten N-alkylierten und N,N'-dialkylierten 2,4,5-Triaryl-2-imidazoline aufzuklären.

In previous works several imidazoline derivatives with very interesting pharmacological properties were synthesized, i.e. (4R,5S)/(4S,5R)-2,4,5-triaryl-2-imidazolines with lipophilic substituents such as chlorine, methyl or methoxy groups in position 2, 4 and 5 of the aromatic moieties. Depending on their substitution pattern these compounds showed cytotoxic effects on cancer cells. The aim of this work was to develop new 2,4,5-triaryl-2-imidazolines and to analyze their structure activity relationship in terms of cytotoxicity. On the one hand structural changes were made by N-alkylation or N,N'-dialkylation and on the other hand compounds with either (4R,5S)/(4S,5R)- or (4R,5R)/(4S,5S)-configuration. Various (4R,5S)/(4S,5R)-2,4,5-triaryl-2-imidazolines with nitro-genous substituents in position 2, 4 and 5 of aromatic moieties were successfully synthesized too. Using microwave technology, synthetic methods were developed allowing a fast and efficient synthesis of the above mentioned compounds. The compounds were analyzed in terms of their cellular effects using different established in- vitro assays. Initially, the inhibiting effect on cell proliferation was investigated using the tumor cell lines A549, MCF-7, MDA-MB-231 and U2OS. In this context the highest cytotoxicity was observed for N,N'-dipropyl-2-imidazolines, i.e. (4R,5S)/(4S,5R)-N,N'-dipropyl-2,4,5-tris-(4-ethylphenyl)-2-imidazoliniumiodide which exhibited an IC50 value of 40 nmol/l on MCF-7 cells. N-alkylation of 2,4,5-triaryl-2-imidazolines led to an increase in cytotoxicity whereas N-methylation or N-ethylation of 4-chlor- and 4-nitro-substituted 2-imidazolines led to a drastic attenuation of the cytotoxic properties. The elongation of alkyl chain and the associated increase in lipophilicity were generally accompanied by a significant decrease of IC50 values. (4R,5S)/(4S,5R)-2,4,5-triaryl-2-imidazolines with nitrogen residues in position 2, 4 and 5 of the aromatic moieties appeared to be less cytotoxic. A change from (4R,5S)/(4S,5R)- to (4R,5R)/(4S,5S)-configuration did not effect cytotoxicity. In further studies the most promising cytotoxic compounds were investigated in terms of their apoptosis-inducing properties. For N,N'-Dimethyl-2,4,5-tris-(4-ethylphenyl)-2-imidazoliniumiodides caspase-3 activity of about 2.5 and positive detection of ssDNA (Fx = 6.5-8.1) were observed whereas for the corresponding monoalkylated compounds single-stranded DNA (Fx = 7.5-7.9) but no caspase-3 activity was found. Due to the structural similarity of the 2,4,5-triaryl-2-imidazolines to nutlin-3a a possible inhibition of hdm2 protein and associated p53 induced cell death were noticed. Immunohistochemical quantification of p53 and hdm2 did not exhibit p53 induced apoptosis for N-alkylated as well as for N,N'-dialkylated (4R,5S)/(4S,5R)-2,4,5-triaryl-2-imidazolines. Interestingly, in A549 cells a higher concentration of hdm2 compared to p53 was found for (4R,5S)/(4S,5R)-2,4,5-tris-(4-chlorphenyl)-2-imidazoline which might indicate hdm2 inhibiting properties. For all investigated compounds with (4R,5R)/(4S,5S)-configuration no p53 activating effect was observed. Although the results of the apoptosis tests have demonstrated that 2,4,5-triaryl-2-imidazolines are able to trigger programmed cell death it appeared that this process was neither p53 induced nor associated with caspase-3 in the executive phase. Therefore further studies are necessary to elucidate the mechanism of action of the N-alkylated and N,N'-dialkylated 2,4,5-triaryl-2-imidazolines.