The UL36-encoded ubiquitin-specific protease in Marek's disease virus replication and tumourigenesis

Abstract

Marek´s disease (MD) is a poultry disease with a worldwide distribution. The disease is caused by MD virus (MDV), an alphaherpesvirus in the Mardivirus genus. MDV causes neurological symptoms and CD4+ T cell visceral lymphomas, which eventually lead to the death of the affected animals. First described in 1907 by Jozef Marek as a slowly progressing chronic polyneuritis, MD became a major worry for poultry producers due to the severity of symptoms and the lack of effective control measures until vaccines were developed in the 1960s. The various vaccines have resulted in a reduction of disease incidence, but not in sterilizing immunity, which has led to constantly increasing virulence of circulating field strains, ultimately leading to the selection of highly virulent viruses. These strains continue to threaten chickens and it is, therefore, important to study MDV genes involved in viral pathogenesis. In addition to the MDV-encoded oncoprotein Meq and the viral telomerase, the UL36 gene plays an essential role in MDV pathogenesis. This gene was recently found to encode a deubiquitinase (DUB). The ubiquitin-specific protease (USP) is embedded in the N-terminal part of the large tegument protein (pUL36). The USP is highly conserved among herpesviruses and replacement of its putative active site cysteine by an alanine had a profound effect on in vitro replication and in vivo tumourigenesis. However, in these previous studies it was not possible to determine which proteins interact with MDV USP, and also if the observed effects were due to structural significance of the N-terminus of the UL36-encoded large tegument protein or solely to its enzymatic activity. In this dissertation, USP-Meq interaction studies were performed and several mutant viruses based on the very virulent RB-1B MDV strain were constructed by two-step Red mediated recombination. The mutants were designed to allow differentiation between USP enzymatic and structural function. Even if the interaction between MDV USP and Meq could not be confirmed, it was shown that both the N-terminal UL36 region and its highly-conserved USP cysteine box are essential for viral replication. Also, ectopical expression of a functional, synthetic USP (SynUSP) in several locations of the MDV genome could not compensate for the absence of a (functional) USP, suggesting that the large tegument protein can only exert its functions if USP is expressed in frame within the UL36 protein. We concluded from our studies that MDV USP has a structural role beyond its enzymatic activity, which implies that the decreased tumourigenesis observed in the absence of an active USP is partly due to MDV replication impairment and not to a direct activity of USP in tumourigenesis. Additionally, specific antibodies for MDV USP and for pUL36 were produced. Two 40 kDa bands were detected with one of the antibodies in MDV-infected cell lysates, which could correspond to cleaved MDV USP, similar to what was previously identified in other herpesviruses.

Die Marek’sche Krankheit (MD) ist eine weltweit verbreitete Erkrankung von Geflügel. Das Virus der Marek’schen Krankheit (MDV), der Auslöser der Erkrankung, wird innerhalb der Alphaherpesviren zum Genus Mardivirus gezählt. Neben neurologischen Symptomen führt die Infektion mit MDV auch zur Entstehung von CD4+ T-Zelllymphomen welche schließlich zum Tod des betroffenen Tieres führen. Nach der Erstbeschreibung der Krankheit als langsam fortschreitende, chronische Polyneuritis im Jahre 1907 durch den Tierarzt Jozef Marek, entwickelte sich MD aufgrund der schwerwiegenden Symptomatik sowie dem Fehlen von effektiven Kontrollmechanismen zu einem großen Problem für die Geflügelindustrie. Die Entwicklung und Einführung von Impfstoffen in den 1960iger Jahren konnte die Inzidenz der Marek’schen Krankheit zwar reduzieren, jedoch wird durch die Vakzination keine sterile Immunität erreicht. Dieser Umstand hat in den letzten Jahrzehnten zur Selektion von hochvirulenten Viren geführt, die sich in einer steigenden Virulenz der zirkulierenden Feldstämme niederschlägt. Da entsprechende Stämme auch weiterhin Geflügelbestände weltweit bedrohen, ist es von entscheidender Bedeutung die für die virale Pathogenese verantwortlichen Gene zu untersuchen. Neben dem von MDV kodierten Onkoprotein Meq sowie der viralen Telomerase ist auch das Gen UL36 an der Pathogenese des Virus beteiligt. In diesem Zusammenhang wurde das Genprodukt pUL36 kürzlich als Deubiquitinase (DUB) beschrieben. Die für die Funktion entscheidene Ubiquitin-spezifische Protease (USP) befindet sich dabei in dem N-terminalen Teil des pUL36. Zudem ist die USP innerhalb der Herpesviren hochkonserviert und der Austausch des katalytischen Cysteins im aktiven Zentrum des Proteins hat einen ausgeprägten Effekt auf die Replikation in vitro sowie die Tumourgenese in vivo. In vorhergehenden Studien war es nicht möglich die Interaktionspartner der MDV USP zu identifizieren. Ungeklärt blieb zudem ob der beschriebene Einfluss auf die Pathogenese von struktureller oder enzymatischer Natur ist. In der vorliegenden Dissertation wurden USP- Meq–Interaktionsstudien durchgeführt. Außerdem wurden, mit Hilfe einer zweistufigen Red-Mutagenese, virale USP-Mutanten erzeugt, die auf dem sehr virulenten MDV Stamm RB-1B basierten. Die Mutanten wurden dabei so konstruiert, dass sie eine Unterscheidung zwischen enzymatischer und struktureller Funktion der USP erlauben. Obwohl eine direkte Interaktion zwischen Meq und USP nicht nachweisbar war, konnte gezeigt werden, dass die N-terminale Region sowie die hochkonservierte USP Cystein-Box des pUL36 für die virale Replikation essentiell sind. Des Weiteren konnte die ektopische Expression einer synthetischen aber funktionalen USP (SynUSP) innerhalb verschiedener Positionen des MDV-Genoms nicht die Abwesenheit der originalen Sequenz kompensieren. Dieses Ergebnis implizierte, dass das Tegumentprotein pUL36 seine Funktion nur ausführen kann wenn die USP im selben Leserahmen exprimiert wird. Aus unseren Untersuchungen folgerten wir, dass MDV USP neben seiner enzymatischen Funktion auch eine strukturelle Rolle innerhalb des Proteins besitzt. Die verminderte Tumourgenese, die in der Abwesenheit einer aktiven USP beobachtet wurde, ist daher wahrscheinlich durch die generelle Beeinträchtigung der viralen Replikation zu erklären und nicht etwa durch eine direkte Aktivität der USP im Prozess der Krebsentstehung. Abschließend wurden spezifische Antikörper gegen das MDV USP sowie pUL36 produziert. Zwei Banden von etwa 40 kDa konnten mit einem der Antikörper in Lysaten infizierter Zellen detektiert werden. Ähnlich wie bei anderen Herpesviren beobachtet, korrespondierten diese Banden in ihrer Größe mit einer gespalten USP.