Microgravity- and shear stress-mediated regulation of E3 ligase NEDD4 and its substrate Cx43 in endothelial cells

Abstract

The reduction of capillary density in microgravity-induced muscle atrophy has been observed by several studies. The cellular and molecular mechanisms leading to these changes remain to be recognized. Therefore, this study was designed at testing endothelial reactions on microgravity, focussing on those which are probably connected to the regulation of blood vessel growth. Since, according to published results from a gene array analysis, one of the most strongly regulated genes by microgravity is E3-ligase NEDD4, the aim of this work was to validate the impact of microgravity and shear stress (as a side effect when producing microgravity) on it, and search for NEDD4-regulated, angiogenesis-related proteins. In addition, previous studies indicated that ADAMTS1, which plays a role in the regulation of angiogenesis, is strongly induced by mechanical forces acting on endothelial cells, namely by shear stress. Here, it was tested if there is any influence of microgravity on ADAMTS1 expression. HUVEC and EAhy926 cells were exposed to constant laminar or pulsatile laminar flow in a cone and plate device developed in the institute´s workshop. Microgravity experiments were performed in a Rotating Wall Vessel bioreactor. Both, NEDD4 and ADAMTS1, were tested under increased shear stress and microgravity. The regulation of genes and proteins was analysed by real time RT-PCR, immunoblotting, and immunoprecepitation, respectively. Additionally, cells were treated with different inhibitors either to block protein degradation or to investigate the role of mechanosensitive signalling pathways in their regulation. NEDD4 is expressed in endothelial cells, co-precipitates with Cx43, and the increase of NEDD4 induced by microgravity correlates with a decrease in Cx43. This interaction between NEDD4 and Cx43 in human endothelial cells was confirmed by immunostaining showing co-localization and by siRNA mediated knockdown of NEDD4 which caused a decrease in Cx43. Accordingly, an increase of Cx43 was shown with inhibitors of the proteasome. However, there was no effect of constant laminar flow on NEDD4 expression. On contrary, an atheroprotective flow profile upregulated NEDD4 while an atheroprone flow profile caused the opposite effect. PI3K and NO˙ production did not play a role in the regulation of NEDD4 by shear stress, so other signalling pathways will be involved. ADAMTS1 was transiently induced by microgravity. Shear stress from 2 dyn/cm2 onwards induced ADAMTS1, whereas atheroprone flow reduced it. Secreted to the cell culture supernatant, ADAMTS1 cleaves TSP1 to its smaller anti-angiogenic fragments. PI3K and NO˙ production are clearly involved in the regulation of ADAMTS1 by shear stress. Likewise, TSP1 was somewhat later but as well transiently induced by microgravity. Taken together, this work supports earlier observations of reduced angiogenesis under microgravity and extends them towards additional cellular mechanisms which contribute to the anti- angiogenic phenotype of endothelial cells under these conditions. Thus, the results of this study are expected to provide better understanding of mechanisms which can contribute not only to the development of different pathological situation observed in astronauts, but also for patients during long bed rest and for those who suffer from atherosclerosis.

Eine reduzierte Kapillardichte bei durch Mikrogravitation ausgelöster Muskelatrophie ist in mehreren Studien beschrieben worden. Dennoch sind die zellulären und molekularen Mechanismen, die zu diesem Verlusst an Kapillaren führen, bisher unbekannt. Diese Studie hatte daher zum Ziel, Reaktionen von Endothelzellen auf Mikrogravitation zu untersuchen, insbesondere solche, für die ein Zusammenhang mit der Regulation des Blutgefäßwachstums besteht. Eine Gene-array Analyse einer anderen Gruppe hatte zuvor gezeigt, dass in Endothelzellen die E3-Ligase NEDD4 besonders deutlich durch Mikrogravitation induziert wird. Daher sollten nun diese Ergebnisse mit anderen Methoden bestätigt und auf Cx43 als Angiogenese-assoziiertes Substrat von NEDD4 ausgedehnt werden. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob das mechanosensitiv induzierte ADAMTS1, ein Angiogeneseinhibitor, auch eine Expressionsregulation durch Mikrogravitation erfährt. Humane umbilikale venöse Endothelzellen und EAhy926 Zellen wurden in einem Konus-Platte-System konstanter laminarer oder pulsatil laminarer Strömung ausgesetzt. Mikrogravitation wurde mithilfe des von der NASA entwickelten „Rotating Wall Vessel“ simuliert. Anschließend wurden die Zellen mittels quantitativer real time RT-PCR, Immunoblotting und Immunpräzipitation untersucht. In weiteren Experimenten wurden die Zellen mit Inhibitoren des Proteasoms oder des Lysosoms, mit einem PI3K-Inhibitor oder L-NAME zur Hemmung der NO˙-Synthese behandelt, um einen etwaigen Beitrag dieser Signalwege zur beobachteten Regulationscharakteristik zu ermitteln. NEDD4 wird in Endothelzellen exprimiert, lässt sich mit Cx43 kopräzipitieren, und sein durch Mikrogravitation erzeugter Konzentrationsanstieg korrelliert mit dem Konzentrationsabfall von Cx43. Die Interaktion von NEDD4 und Cx43 wurde durch Kolokalisation in der konfokalen Lasermikroskopie sowie nach siRNA vermitteltem knock down von NEDD4 bestätigt. Entsprechend führte die Hemmung des Proteasoms zum Anstieg von Cx43. Konstante, laminare Strömung hatte dagegen keinen Einfluss auf die Expression von NEDD4. Wohl aber wurde NEDD4 durch ein atheroprotektives Strömungsprofil induziert, durch ein atherogenens supprimiert. PI3K und NO˙ spielten dabei keine Rolle. ADAMTS1 wurde durch Mikrogravitation transient induziert. Schubspannungen über 2 dyn/cm2 führten zu einem starken Anstieg von ADAMTS1, während es durch ein atherogenes Strömungsprofil supprimiert wurde. In den Kulturüberstand sezerniert degradiert ADAMTS1 TSP1 zu einem antiangiogenen, 70 kDa großen Fragment. PI3K und NO˙ Produktion sind gleichermaßen notwendig für die strömungsabhängige Expressionsregulation von ADAMTS1. Auch TSP1 wurde durch Mikrogravitation transient induziert. Diese Arbeit unterstützt die bereits bestehende Auffassung von einer reduzierten Angiogenese unter den Bedingungen der Schwerelosigkeit und erweitert sie um zelluläre/molekulare Mechanismen, die zur Erklärung des antiangiogenen Phänotyps der Endothelzellen bei Schwerelosigkeit beitragen können. Diese Ergebnisse tragen daher bei zu einem besseren Verständnis pathophysiologischer Vorgänge bei Astronauten (bzw. Kosmonauten u.ä.) und – klinisch relevanter – bei Patienten mit langer Immobilisation. Wegen der Rolle von Cx43 bei der Entwicklung von Arteriosklerose könnten die hier vorgelegten Ergebnisse über NEDD4 auch in diesem Zusammenhang von Interesse sein.