Induktion von Desinfektionsmittelresistenzen und Co-Induktion von Antibiotikaresistenzen bei Escherichia coli und Enterococcus spp. aus Nutztierhaltungen

Abstract

Im Rahmen der Infektionsprophylaxe und der Bekämpfung von Krankheitsausbrüchen werden in der Tierhaltung jährlich enorme Mengen von Desinfektionsmitteln eingesetzt. Da es nicht nur in der Humanmedizin eine wachsende Anzahl von Berichten über Desinfektionsmittelresistenzen gegen bestimmte Wirkstoffe gibt, welche zudem teilweise mit Antibiotikaresistenzen einhergehen, gilt diese Befürchtung auch für den Einsatz von Desinfektionsmitteln in der Tierhaltung. Im Fokus der durchgeführten Untersuchungen stand somit die Frage, inwieweit subinhibitorische Konzentrationen von Desinfektionsmitteln, wie sie durch zahlreiche beeinträchtigende Faktoren in der Tierhaltung entstehen können, zu einer Induktion von Resistenzen gegen diese bzw. zu einer Co-Induktion von Antibiotikaresistenzen führen können. Um dieser Frage nachzugehen, wurde die minimale Hemmkonzentration (MHK) von drei typischerweise in der Tierhaltung eingesetzten Desinfektionsmitteln (Peressigsäure, Glutaraldehyd und Ameisensäure) von Escherichia coli als gramnegative und Enterococcus spp. als grampositive, ubiquitäre Bakterien aus Nutztierhaltungen, bestimmt. Dies erfolgte im Doppelansatz nach den DVG-Richtlinien der Desinfektionsmittelprüfung sowohl bei den jeweiligen Referenzstämmen als auch bei je neun Feldisolaten aus Nutztierhaltungen jeder Gruppe. Zudem wurden ESBL-bildende und ESBL-negative E. coli im Vergleich untersucht, um die Auswirkungen bereits vorhandener Antibiotikaresistenzgene auf eine Desinfektionsmittelresistenz bei E. coli einschätzen zu können. Nachdem alle Testkeime zehnmalig subinhibitorischen Desinfektionsmittelkonzentrationen ausgesetzt wurden, wurde eine erneute MHK-Bestimmung durchgeführt um zu ermitteln, inwieweit sich diese verändert hat. Nach anschließend durchgeführten Stabilitätspassagen ohne Desinfektionsmittelzusatz wurde wieder anhand der MHK bestimmt, wie stabil die beobachteten Sensibilitätsveränderungen gegen die Desinfektionsmittel waren. Es wurden ausschließlich temporäre Toleranzerhöhungen, welche nie mehr als eine MHK- Stufe umfassten induziert, was auf ein verhältnismäßig geringes Resistenzrisiko bei dem Einsatz der untersuchten Desinfektionsmittel hindeutet. Im Gegensatz dazu konnte jedoch ein Konvergieren bzw. sogar zeitweises Überschreiten der MHK im Vergleich zu den vorgeschriebenen Gebrauchskonzentrationen bei zwei von drei getesteten Desinfektionsmitteln beobachtet werden. Im letzteren Fall kann man von der Induktion einer instabilen Resistenz sprechen, welche bei dem glutaraldehydhaltigem Desinfektionsmittel Permanent neu® bei mehreren Enterococcus-Isolaten beobachtet wurde. Durch die Erhöhung der MHK unter den idealen Bedingungen im Labor kann man darauf schließen, dass es unter den schwierigeren Gegebenheiten in der Stallumgebung vermutlich ebenfalls schnell zu einer Beeinträchtigung des Desinfektionserfolgs kommen kann. Zudem ist bemerkenswert, dass in den Versuchen mit dem glutaraldehydhaltigem Präparat die Enterococcus Feldisolate eine höhere Toleranz gegen den Wirkstoff zeigten als der entsprechende Enterococcus- Referenzstamm aus der Desinfektionsmittelprüfung. Das äquivalente Verhalten der ESBL-negativen und der ESBL-bildenden E. coli zeigt, dass zumindest das Vorhandensein dieser multiplen Resistenzen gegen ß-Laktamantibiotika bei E. coli keinen Wirkungsverlust der untersuchten Desinfektionsmittel (Peressigsäure, Glutaraldehyd und Ameisensäure) erwarten lassen. Um einen Einfluss der veränderten MHK der Desinfektionsmittel auf die Antibiotikaempfindlichkeit der Bakterien zu untersuchen, wurde vor und nach den Passagen mit subinhibitorischen Desinfektionsmittelkonzentrationen mit ausgewählten Vertretern der einzelnen Testkeimgruppen zudem ein Agardiffusionstest mit jeweils zwölf verschiedenen antibiotischen Wirkstoffen durchgeführt. Dabei konnten jedoch in keinem Fall Hinweise gefunden werden, die auf eine Korrelation zwischen den beobachteten MHK-Erhöhungen der Desinfektionsmittel und einem Sensibilitätsverlust der untersuchten Antibiotika hingedeutet hätten. Jedoch fiel auf, dass die Feldisolate der einzelnen Bakteriengruppen stets mehr Resistenzen gegen die untersuchten antibiotischen Wirkstoffe aufwiesen als die entsprechenden Referenzstämme. Da die Ausbildung von Resistenzen der einzelnen Bakterienspezies wahrscheinlich auf spezifischen statt auf generischen Resistenzmechanismen basiert, kann man aus den durchgeführten Untersuchungen lediglich schließen, dass eine Induktion stabiler oder hochgradiger Resistenzen der untersuchten Keimgruppen gegen die getesteten Desinfektionsmittel Peressigsäure, Glutaraldehyd und Ameisensäure in der Stallumgebung eher unwahrscheinlich ist. Jedoch kann dies nicht völlig ausgeschlossen werden, da es möglich ist, dass sich dies bei einem anderen Versuchsaufbau anders darstellen würde. In Anbetracht der teilweise sehr geringen Sicherheitsspannen der Präparate ist ein Versagen der Desinfektion unter den schwierigen Bedingungen in der Tierhaltung jedoch ein realistisches Szenario. Somit bleibt die Wichtigkeit eines fehlerfreien und verantwortungsbewussten Desinfektionsmitteleinsatzes hervorzuheben.

For infection prophylaxis and to fight outbreaks of diseases animal husbandry utilizes enormous amounts of disinfectants each year. Not only humane medicine finds itself confronted with a growing number of reports about resistances against specific disinfectant agents, which additionally are partially accompanied by resistances against antibiotics. This apprehension is shared as well by disinfectant use in animal husbandry. Focus of this thesis was therefore to research to what extent subinhibitory concentrations of disinfectants, which are likely to be caused by numerous interfering factors in animal husbandry, will lead to the induction of resistances against those agents, or co-induction of resistances against antibiotics. To research this question the minimum inhibition concentration (MIC) of three typical disinfectants used in animal husbandry (peracetic acid, glutaraldehyde and formic acid) of Escherichia coli as gram-negative and Enterococcus spp. as gram-positive ubiquitous bacteria found in livestock husbandry was determined. Duplicate measurement following DVG guidelines for disinfectant review was employed for both the corresponding reference microbial strains and the nine field isolates from livestock husbandry of each group. Additionally, for comparison, ESBL-producing and ESBL-negative E. coli were tested to research the influence of preexisting resistance genes against antibiotics on resistances of E. coli against disinfectants. After all tested germs had been exposed ten times to subinhibitory concentrations of disinfectants a second MIC determination was conducted in order to find out how the MIC changed. After a following period of unexhibited growth the MIC was again determined in order to find out the stability of the observed change in sensibility. Only temporary changes in levels of tolerance were observed, never amounting to more than one MIC level, which suggests a relatively low risk of inducing resistances against the researched disinfectants. Contrary to that a convergence, respectively a temporary transgression of the MIC in comparison to the concentrations ready to use for two of the three disinfectants was observed. The latter case can be labeled as an induction of an instable resistance, which was observed using the glutaraldehyde based disinfectant Permanent neu® for several Enterococcus isolates. By aligning the MIC to the concentrations ready to use under ideal laboratory conditions it can be deducted that under the harsh conditions of a barn environment disinfectant effectivity will presumably quickly deteriorate. Additionally, it is alarming that in the experiments using the glutaraldehyde based disinfectant the Enterococcus field isolates showed a higher tolerance against that agent than the corresponding Enterococcus reference strain from disinfectant review. The equivalent behavior of ESBL-negative and ESBL-producing E. coli shows that at least the existence of multiresistances against ß-lactam antibiotics in E. coli will not lead to reduced sensibility against disinfectants (peracetic acid, glutaraldehyde, formic acid). To analyze the influence of the changed MIC of the disinfectants on antibiotic sensibility of the bacteria an additional agar diffusion test with twelve different antibiotic agents was made before and after each exhibition of selected test germs to subinhibitory concentrations of disinfectants. In doing so no indication of a correlation between the observed rise of the MIC of the disinfectants and a loss of sensibility against the tested antibiotics was found. Nonetheless, it was noticed that the field isolates of the different groups of bacteria always showed a higher resistance against the tested antibiotic agents than the corresponding reference strains. Since the development of resistances of the different species of bacteria is most likely based on specific rather than generic resistance mechanisms, it can only be deduced from the conducted research that an induction of stable or highly effective resistances against the disinfectants peracetic acid, glutaraldehyde and formic acid in the researched group of test germs is unlikely in a barn environment. Such a development of a resistance can still not be completely ruled out since it is deemed possible that a different setup of the experiment might lead to a different conclusion. In consideration of the partially rather small safety margins of the products used in this thesis a failure of disinfection under the difficult conditions in animal husbandry is a realistic danger. Therefore, the importance of a correct and responsible application of disinfectants should be especially noted.