Methodik und Anwendung der Scanning Photostimulation zur Analyse der neuronalen Konnektivität im medialen entorhinalen Cortex

Abstract

Die Scanning-Photostimulation stellt eine etablierte Methode zur Analyse der funktionellen monosynaptischen Konnektivität in akuten Hirnschnitten dar. Licht-induzierte synaptische Signale dienen hierbei als Indikatoren für die überschwellige Aktivierung präsynaptischer Neurone. Ein solcher Ansatz erfordert die eindeutige Unterscheidung zwischen photo-induzierten und spontanen synaptischen Signalen. In dieser Arbeit wird ein neuartiger Algorithmus zur reliablen Detektion präsynaptischer Neurone vorgestellt, ungeachtet einer hohen synaptischen Hintergrundaktivität von bis zu 10 Hz. Auf Basis einer amplitudenfreien, binären Afferenzkarte, die die Existenz photoinduzierter Potentiale dokumentiert, identifiziert der Algorithmus anhand räumlicher Korrelationen all jene Regionen, in denen mit hoher statistischer Signifikanz mindestens ein präsynaptisches Soma lokalisiert ist (Hit-Points). Das Besondere an dem Algorithmus ist die Tatsache, dass er auf Basis eines Single-Trial-Ansatzes trotz eines niedrigen Signal-Rausch-Abstandes reliable Ergebnisse liefert. Die Reliabilität der Detektion wird durch die Analyse der Intertrial-Variabilität und durch TTX-Experimente dokumentiert. Ausgehend von den Hit-Punkten wird nachfolgend unter Zuhilfenahme eines Bayes-Schätzers die Anzahl der zugrundeliegenden präsynaptischen Neurone geschätzt. Für die Sternzelle des entorhinalen Cortex findet sich eine intralaminäre Schicht-II- Konnektivität von rund 34 Zellen/mm2. Nach diesem 'Proof-of-methods' der Datenanalyse wurden die grundlegenden intrinsischen Konnektivitätsprinzipien der beiden Hauptzellen des medialen entorhinalen Cortex, der Sternzelle und der Schicht-II- und -III-Pyramidenzellen des medialen entorhinalen Cortex bestimmt. Hierbei zeigte sich eine Zelltyp-spezifische Organisation des ascendierenden interlaminären Eingangs: Die räumliche Ausdehnung des Eingangs ist für Sternzellen signifikant kleiner (210 µm) als für Pyramidenzellen (470 µm); darüber hinaus zeigten ausschließlich die Afferenzen zur Schicht-III- Pyramidenzellen einen zur vertikalen Zellachse orientierten asymmetrischen Offset. Abschließend wird ein Ausblick auf das Potential der Photostimulation in Kombination mit anderen Technologien, insbesondere optogenetischer Verfahren, zur Analyse der dynamischen Interaktion neuronaler Mikroschaltkreise und damit der zugrundeliegenden verteilten Algorithmen gegeben.

Scanning photostimulation is a well-established method for studying the functional microcircuitry in brain slices. Light-evoked responses are thereby taken as an indicator for a connected presynaptic partner. Such an approach thus requires a clear distinction between the photo-evoked and the spontaneous responses. Here we show that, for a data set from entorhinal cortex layer II with high spontaneous synaptic rates of up to 10 Hz, it is possible to identify presynaptic sites. The underlying detection algorithm is based on the finding that a presynaptic cell has several neighboring activation sites, resulting in the clustered appearance of specific photo-evoked inputs. The main idea behind this approach is to identify 'hit' locations at which the number of intracellularly recorded synaptic events is signifcantly larger as expected from the hypothesis of statistical independence. The algorithm works without making use of amplitude information of the synaptic signals and for single trials, i.e., each site is stimulated only once. As a proof-of-methods the hit maps are tested upon reliability by repeated stimulations and by blocking synaptically mediated responses via TTX. Furthermore, based on the hit density of surrogate data, we devise a Bayesian formalism to estimate the number of presynaptic partners. In these simulations we find good agreement between estimated and real number of input cells, which shows that the hit density can be used as a reliable measure for afferent connectivity. The combination of both, photostimulation and detection algorithm enables use to investigate the functional microcircuitry of two main cell types of the medial entorhinale cortex, the stellate and pyramidal cells. We found cell-type- specific intralaminar and ascending interlaminar feedback inputs. The ascending interlaminar inputs display distinct organizational principles depending on the cell-type and its position within the superficial lamina: the spatial spread of inputs for stellate cells is narrower than for pyramidal cells, while inputs to pyramidal cells in layer 3, but not in layer 2, exhibit an asymmetric offset to the medial side of the cell's main axis. Finally, we will review the current and future capabilities of photostimulation in combination with other techniques such as optogenetics for studying neuronal microcircuits and the underlying distributed logical algorithms.