Antiretrovirale Therapie und Resistenz von HIV-1

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war, die potentielle Ausbreitung replikationskompetenter resistenter HIV in Deutschland zu untersuchen. Die genotypische Resistenzanalyse von 136 HIV-Infektionen aus Blutproben therapie- naiver PatientInnen mit dokumentierter Serokonversion zwischen Januar 1996 und Dezember 2001 zeigte, dass 47% der Viren mindestens eine resistenz-assoziierte Mutation in den thera-peutischen Zielenzymen Protease bzw. Reverse Transkriptase enthielten. In 15 Infektionen (11%) wurde anhand der phänotypischen Resistenzuntersuchung eine in vitro Resistenz der Viren nachgewiesen (Kooperation mit dem NRZ Retroviren, Erlangen), wobei der anhand des genotypischen Resistenzmusters erwartete Phänotyp mit dem tatsächlich gemessenen relativ gut überein stimmte (4 NRTI, 2 NNRTI, 3 PI). In sechs Fällen konnte Resistenz gegen zwei Wirkstoffklassen (NRTI/PI bzw. NRTI/NNRTI) nachgewiesen werden. Ein gehäuftes Auftreten der Übertragung dieser multiresistenten Viren in den Jahren 2000/2001 wurde beobachtet, erreichte jedoch keine statistische Signifikanz. Die PatientInnen aus dem Studienkollektiv, die im Rahmen der Serokonverterstudie des Robert Koch- Institutes rekrutiert wurden (Kooperation mit Infektionsepidemiologie), hatten sich fast ausschließlich in Deutschland - eine Infektion stammte aus den Niederlanden, eine aus Thailand - infiziert. Die meisten Infektionen wurden durch homosexuelle Kontakte über-tragen. Von 50% der Infizierten konnte eine Blutprobe während bzw. innerhalb von drei Monaten nach der Serokonversion erhalten werden. Fast alle der hier untersuchten Viren gehören dem HIV-1 Subtyp B an. HIV-1 non-B Infektionen wurden in zwei Fällen nachgewiesen (eine HIV-1 Subtyp C und eine Subtyp D Infektion). Anhand von Blutproben therapie- naiver nigerianischer PatientInnen (Kooperation mit University of Jos, Nigeria) wurde die in vitro Resistenz von Viren des HIV-1 Subtyps G bzw. CRF02-AG untersucht. Die hier nachgewiesenen subtypspezifischen resistenz- assoziierten Mutation im pol-Gen, führten jedoch nicht zu einer messbaren phänotypischen Resistenz der untersuchten Viren. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die virale Fitness resistenter übertragener Viren in Wachstumskinetiken im Vergleich zu sensitiven Wildtypviren untersucht. Dazu wur-den NNRTI/NRTI und NRTI/PI resistente und sensitive, infektiöse, rekombinante HIV-1 Klone hergestellt, deren Vermehrungseffizienz in einem Reportergen Assay (SEAP), durch p24-Antigenbestimmung, Ermittlung des infektiösen Titers (TCID50) und Quantifizierung der viralen RNA bestimmt. Es wurde eine im Vergleich zum sensitiven Wildtypklon geringere Vermehrungseffizienz der resistenten Virusklone beobachtet. Zusätzlich konnte in einem real time RT-Assay (TaqMan) gezeigt werden, dass die in vitro Infektion von lymphoiden Zellen mit resistenten HIV Klonen im Vergleich zu Infektionen mit Wildtypklonen zu geringeren RT-Aktivitäten im Zellkulturüberstand führte. Ein Einfluss einzelner Schlüsselmutationen auf die virale Fitness, insbesondere der in der Literatur als fitnessmindernd beschriebenen M184V Substitution der RT, konnte mit den verwendeten Methoden nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass in Deutschland resistente, replikationskompetente HIV-1 übertragen werden. Die Überwachung der Ausbreitungsdynamik und die Unter-suchung der Vermehrungsfähigkeit antiretroviral resistenter HIV sowie die Langzeit- beobachtung der untersuchten Serokonverter wird im Rahmen des deutschen HIV- Kompetenznetzwerkes und des europäischen Programms SPREAD erfolgen.

Subject of this work was to investigate the potential spreading of replication competent and resistant HIV in Germany. Genotypic resistance analysis of 136 HIV infections of therapy-naive patients with documented seroconversion between January 1996 and December 2001 showed that 47% of the viruses contained at least one resistance-associated mutation within the therapeutic target enzymes, protease and reverse transcriptase. Phenotypic analysis demonstrated 15 infections with in vitro resistant viruses (in cooperation with the National Reference Centre for Retroviruses, Erlangen). The expected phenotype, which was deduced from the genotype correlated mostly with the measured phenotype (4 NRTI, 2 NNRTI, 3 PI). In six cases resistance against two drug-classes could be detected (NRTI/PI and NRTI/NNRTI, respectively). Frequent transmission of these multi-drug resistant viruses was seen in 2000/2001, but it did not reach statistical significance. Patients were recruited within the seroconverter study (Robert Koch-Institut, in cooperation with the Department for Infection Epidemiology). They had been infected mostly in Germany, one infection was from Thailand, one from The Netherlands. Homosexual contacts represented the main risk of infection. In 50% of the therapy-naive seroconverters blood samples could be collected during seroconversion or within three months after seroconversion. In almost every case the examined viruses belonged to HIV-1 subtype B. HIV-1 non-B infections were detected in only two cases (one HIV-1 subtype C and one subtype D). The in vitro resistance of viruses belonging to HIV-1 subtype G and CRF02-AG was studied in blood samples of therapy-naive patients from Nigeria (in cooperation with University of Jos, Nigeria). The detected subtype specific resistance-associated mutations in the investigated viruses did not result in measurable resistance in the phenotype. In the second part of this work the viral fitness of resistant transmitted viruses was analyzed in comparison with sensitive wildtype virus. NNRTI/NRTI and NRTI/PI resistant recombinante HIV-1 clones were produced. The replication efficiency of these virus clones was examined employing a reportergene assay (SEAP), p24-antigene determination, quantification of the infectious titer (TCID50) and of the viral RNA. Compared with the sensitive wildtype HIV clone, the resistant virus clones showed a decreased replication efficiency. Additionally a decreased RT-activity in cell culture after infection of lymphoid cells with resistant HIV clones compared with wildtype could be detected. An influence of single key mutations, the M184V substitution of the RT for example, which is known to decrease viral fitness, could not be demonstrated. The results of this work show that resistant and replication competent HIV-1 were transmitted in Germany. Surveillance of the dynamic of spreading and the investigation of the replication efficiency of antiretroviral resistant HIV as well as the long- term follow up of the investigated seroconverters will take place within the HIV competence network and the European program SPREAD.