NAD+-abhängige Signalwege in Mitochondrien: ADP-Ribosyltransferase und NAD+-Glycohydrolase

Abstract

Die durch Prooxidantien induzierte Calciumfreisetzung aus Mitochondrien wurde bisher mit einer NAD+-Glycohydrolase (NADase)-Aktivität und der ADP- Ribosylierung spezifischer Proteine in Zusammenhang gebracht. Es wurde vorgeschlagen, daß die mitochondriale NADase zunächst aus NAD+ Nikotinamid und ADP-Ribose bildet. Freie ADP-Ribose würde daraufhin zu einer nicht- enzymatischen, kovalenten Modifikation von Proteinen führen, die mit dem Calcium-Efflux-System der Mitochondrien in Beziehung stehen. Ein derartiger Mechanismus weist der Hydrolyse des NAD+, katalysiert durch die mitochondriale NADase, eine Schlüsselrolle in der Calcium-Freisetzung dieser Organellen zu. In der vorliegenden Arbeit wird hingegen die Identifizierung der NAD+-Glycohydrolase aus Mitochondrien der Rinderleber als ein Mitglied der Klasse multifunktioneller ADP-ribosyl Cyclasen/cyclische ADP-Ribose Hydrolasen dargestellt. Diese potentiellen "second messenger" Enzyme katalysieren die Bildung und den Abbau von cyclischer ADP-Ribose (cADP-Ribose), einem hochwirksamen Nukleotid in der intrazellulären Calcium-Mobilisierung. Die erzielten Ergebnisse unterstützen ein neuartiges Modell der prooxidans- induzierten Calciumfreisetzung aus Mitochondrien, die durch die Bildung des spezifischen Botenmoleküls cADP-Ribose erklärt werden kann und nicht durch eine nicht-enzymatische Modifikation mitochondrialer Proteine mit ADP-Ribose. Die ADP-Ribosylierung in Rinderleber-Mitochondrien bei Verwendung von NAD+ als Substrat erfolgt unter zahlreichen Bedingungen (nahezu) unvermindert, unter denen die NADase substantiell inhibiert wird. Während der Reaktion werden spezifisch zwei mitochondriale Proteine ADP-ribosyliert, deren Molekulargewichte zu ca. 26 bzw. 53 kDa bestimmt werden konnten. Die mitochondriale ADP-Ribosylierung scheint unter den gewählten Bedingungen über einen enzymatischen Mechanismus zu verlaufen und nicht über einen nicht- enzymatischen Transfer freier ADP-Ribose, die zunächst aus NAD+ durch die NADase-Aktivität generiert werden muß. Die chemische Stabilität der ADP- Ribose-Protein-Bindungen weist auf Cysteinreste als Hauptakzeptor-Aminosäuren hin. Zusätzlich konnte die Aldehyd-Dehydrogenase aus Hefe mittels der mitochondrialen Aktiviät aus Rinderleber und NAD+ als Substrat ADP-ribosyliert werden. Die Vorbehandlung der Aldehyd-Dehydrogenase mit N-Ethylmaleimid, einem thiol-spezifischen Reagenz, vermindert ihre enzymatische Modifikation deutlich. Diese Befunde lassen auf die Anwesenheit einer cysteinspezifischen ADP-Ribosyltransferase in Mitochondrien der Rinderleber schließen. Zusammengenommen weisen die erzielten Ergebnisse dem mitochondrialen NAD+-Pool - neben seiner Funktion in der Energieübertragung - eine weitere Rolle in der Signaltransduktion zu.

NAD+ glycohydrolase (NADase) activity and ADP-ribosylation have been proposed to be involved in the pro-oxidant induced calcium efflux from mitochondria. It has been suggested that NADase activity results in the generation of free ADP- ribose from NAD+, which in turn would lead to non-enzymatic covalent modification of mitochondrial proteins related to the calcium release system. Such a mechnism would assign hydrolysis of NAD+ by NADase a key step in the calcium efflux from these organelles. However, the present work describes the identification of bovine liver mitochondrial NAD+ glycohydrolase as a member of the class of multifunctional ADP-ribosyl cyclases/cyclic ADP-ribose hydrolases, known to be potential second messenger enzymes. These enzymes catalyze the synthesis and degradation of cyclic ADP-ribose (cADP-ribose), a potent intracellular calcium-mobilizing agent. The results support a new model for the pro-oxidant-induced calcium release from mitochondria involving cADP- ribose as a specific messenger, rather than the non-enzymatic modification of proteins by ADP-ribose. Moreover, it was found that under several conditions, which strongly inhibit the NADase, the extent of ADP-ribosylation in bovine liver mitochondria with NAD+ as substrate was only slightly diminished, if at all. The reaction led to the specific modification of two proteins with apparent molecular masses of approx. 26 and 53 kDa, respectively. Under these selected conditions mitochondrial ADP-ribosylation seems to occur as an enzymatic reaction, rather than a non-enzymatic transfer of ADP-ribose previously liberated from NAD+ by NADase activity. The chemical stability of the protein-ADP-ribose bonds in mitochondria indicated that cysteine residues are the predominant acceptors. Furthermore, yeast aldehyde dehydrogenase was efficiently ADP-ribosylated utilizing the mitochondrial activity and NAD+ as substrate. Pretreatment of this acceptor with N-ethylmaleimide, a thiol- specific reagent, substantially decreased its modification. It is, therefore, concluded that bovine liver mitochondria contain a cysteine-specific ADP- ribosyltransferase. Besides its function in energy-conversion reactions, the results presented establish an additional role of the mitochondrial NAD+-pool - the transduction of signals.