Etablierung eines in vitro Modells des caninen malignen Hämangioendothelioms

Abstract

Das maligne Hämangioendotheliom ist eine häufige viszerale Tumorform des Hundes. Es ist ein hochmaligner Tumor der Blutgefäße, der von deren Endothelzellen abstammt. Aufgrund des aggressiven Verhaltens des Tumors ist eine kurative Therapie in der Regel nicht möglich, generell ist die Prognose schlecht. Nach Diagnose der Erkrankung leben nur wenige der Patienten länger als ein Jahr. Methoden zur Früherkennung gibt es derzeit nicht. Ziel dieser Arbeit war es ein in vitro Modell des malignen Hämangioendothelioms zu etablieren. Hierfür sollten Zellen des Tumors isoliert, identifiziert und charakterisiert werden. Das Modell soll einerseits dazu dienen neue Erkenntnisse zur zellulären Entstehung dieses hochmalignen Tumors zu gewinnen und andererseits künftig die Prüfung neuer Chemotherapeutika mit einem Minimum an Tierversuchen zu ermöglichen. Da die Milz bevorzugte und häufigste Entstehungslokalisation des Tumors ist, wurde neoplastisch entartetes Milzgewebe mehrerer Hunde in vitro kultiviert. Zum Vergleich wurden auch Endothelzellen aus einer gesunden Milz isoliert. Es wurde eine Strategie zur Identifizierung der Zellen erarbeitet. Diese setzte sich aus folgenden Arbeitsschritten zusammen: 1. dem immunzytochemischen Nachweis der endothelzellspezifischen Marker vWF, CD31, Tie-2 und CD51/61; 2. dem Nachweis bestimmter Lektine; 3. der Analyse des Wachstumsmusters der Zellen. Isoliert und in vitro kultiviert wurden Endothelzellen aus neoplastisch entartetem Gewebe der Milz von drei Hunden und der unveränderter Milz eines vierten Hundes. Die Zellen aus den tumorös entarteten caninen Milzen konnten bis zu 145 Tagen reproduzierbar kultiviert werden. Die Zellen, die aus einer unveränderten caninen Milz isoliert waren, konnten nur 80 Tage lang in vitro kultiviert werden. Im Laufe der in vitro Kultivierung wurden deutliche Unterschiede der Kulturen aus den malignen Hämangioendotheliomen und der Kultur aus einer unveränderten Milz beobachtet. Die neoplastisch entarteten Zellen zeichneten sich in vitro durch eine hohe Proliferationsrate bei annähernd exponentiellem Wachstum aus. Im Gegensatz hierzu zeigten die Zellen aus der gesunden Milz eine deutlich niedrigere Proliferationsrate bei fast linearem Wachstum. Ein weiterer Unterschied zwischen den neoplastischen und den gesunden Zellen zeigte sich in der Tatsache, dass erstere bereits deutlich früher dreidimensionale Netze aus kapillarähnlichen Strukturen bildeten. Der Ab- bzw. Aufbau neuer gefäßähnlicher Strukturen (vaskuläres Remodelling) konnte in den Kulturen aus den entarteten Milzen mehrfach beobachtet werden, während dies bei den Endothelzellen aus der gesunden Milz nicht beobachtet werden konnte. Die Zellkulturen aus den entarteten Geweben waren außerdem ohne exogene Bereitstellung extrazellulärer Matrixkomponenten in der Lage dreidimensionale Netze auszubilden. Diese Fähigkeit besaßen die Zellen der Kultur CSC nur in eingeschränktem Maß. Die endotheliale Identität der in dieser Arbeit charakterisierten Zellen wurde mit dem Nachweis der spezifischen Endothelzellmarker vWF, CD31 und Tie-2 bewiesen. Die Mehrzahl der Zellen aus den Kulturen der gesunden Milz reagierte mit den verwendeten Endothelzellmakern intensiv immunopositiv. Auch von den Zellen der tumorös entarteten Milzen wurden diese Endothelzellmarker exprimiert. Während Tie-2 mit gleicher Intensität von den malignen Zellen exprimiert wurde, zeigten sie eine deutlich schwächere Markierung mit vWF und CD31. Die letztgenannten Ergebnisse wurden als Hinweis für die Entdifferenzierung dieser Zellen gewertet. Im Gegensatz dazu war das Integrin CD51/61 in den tumorös entarteten Zellen stärker exprimiert als in den Zellen aus dem normalen Milzgewebe. Da CD51/61 auch als Tumormarker eingesetzt wird, indizierte dieses Ergebnis die Transformation und Malignität der Zellen. Lektinzytochemische Untersuchen wurden mit vier verschiedenen Lektinen (UEA I, Con A, DBA und WGA) durchgeführt. Die verwendeten Lektine zeigten eine deutliche Affinität zu den isolierten Zellen der drei untersuchten Kulturen, es konnten aber keine signifikanten Unterschiede zwischen den Endothelzellpopulationen herausgearbeitet werden. Transmissionselektronenmikroskopisch konnte der endotheliale Charakter der untersuchten Zellen anhand der Lumenbildung nachgewiesen werden. Ein elektronenmikroskopischer Nachweis endothelzelltypischer Zellorganellen (Weibel-Palade-Körperchen) konnte nicht erstellt werden. Dieses in vitro Modell stellt ein kostengünstiges System dar, mit dem weiterführende Untersuchungen zur Entstehung und speziellen Charakterisierung des caninen malignen Hämangioendothelioms durchgeführt werden können. In Zukunft soll dieses Modell zur Identifizierung spezifischer und therapeutisch nutzbarer Inhibitoren eingesetzt werden. Im Hinblick auf eine Reduktion von Tierversuchen durch Ersatz- und Ergänzungsmethoden kommt dem in der vorliegenden Arbeit etablierten in vitro Modell des malignen Hämangioendothelioms damit eine besondere Bedeutung zu.

The malignant hemangioendothelioma (hemangiosarcoma) is a frequent visceral tumour seen in dogs. It is a highly malignant neoplasm of vascular endothelial origin. Because of the aggressive behaviour of the tumour curative therapy is not possible and in general prognosis is poor. After diagnosis only a few of the patients live longer than one year. There are currently no methods of early diagnosis. The purpose of this study was to establish an in vitro model of the malignant hemangioendothelioma. Cells of the tumour should be isolated, identified and characterised. The resulting model should increase knowledge on the cellular origin of this highly malignant tumour and allow the testing of chemotherapeutics with a minimum of animal experiments in the future. Because the spleen is a preferred and the most frequent origin of tumour localisation, transformed splenic tissue of several dogs was cultivated in vitro. Endothelial cells from a healthy spleen were isolated as well. A strategy was set up to identify the cells. This consisted of the following steps: 1\. immunocytochemical labelling with specific markers for endothelial cells: vWF, CD31, Tie-2 and CD51/61; 2. the labelling with certain lectins; 3. the analysis of the growth pattern of the cells. Endothelial cells were isolated and cultivated in vitro from transformed splenic tissue of three dogs and the healthy spleen of one dog. Cells taken from neoplastic canine spleens could be cultivated reproducibly up to 145 days. Cells from the healthy canine spleen could be cultivated 80 days in vitro only. During in vitro cultivation differences were observed between the cultures from the malignant hemangioendothelioma and the culture from the healthy spleen. The neoplastic cells in vitro showed a high proliferation rate with exponential growth. In contrast, the cells from the healthy spleen showed a clearly lower proliferation rate with almost linear growth. Neoplastic cells earlier three- dimensional net-working and formation of capillary-like structure. Vascular remodelling was observed in the cultures from neoplastic spleens, whereas this phenomenon could not be observed in endothelial cells from the healthy spleen. Moreover, the neoplastic cell cultures developed three dimensional networks without any supply of extra-cellular matrix components. In the cells of the CSC culture this phenomenon was observed only in limited dimension. The endothelial identity of the cells was shown by labelling with the specific endothelial cell markers vWF, CD31 and Tie-2. The majority of healthy spleen cells reacted intensely immunopositively with the endothelial cell markers. Endothelial markers were also expressed by neoplastic cells. While Tie-2 showed the same intensity in the malignant cells, a clearly lower labelling was found for vWF and CD31. These results were interpreted as an indication for dedifferentiation of these cells. In contrast Integrin CD51/61 was stronger immuno-localized in neoplastic cells than in cells of normal spleen tissue. Because CD51/61 is also used as a tumour marker, this result indicated the transformation and malignancy of the cells. Lectincytochemical labelling was carried out with four different lectins (UEA I, Con A, DBA and WGA). These lectins showed a clear affinity to the isolated cells of investigated cultures, however, no significant difference was presented between the endothelial cell populations. The endothelial character of the investigated cells was demonstrated also by electronmicroscopical analysis. Typical endothelial organelles (Weibel-Palade-bodies) were not seen. This in vitro model constitutes a reasonable system for continuing investigations and characterisation of the canine malignant hemangioendothelioma. In the future this model might be used to identify inhibitors of endothelial growth. With regard to a reduction of animal experiments the present study might be useful.