DNA-Methylierungsmuster im foxp3 Gen in humanen CD4+ FOXP3-exprimierenden T-Zellen

Abstract

Regulatorische T-Zellen gewinnen aufgrund ihrer Relevanz hinsichtlich der Ursache und prognostischen Aussagekraft bei Autoimmunerkrankungen, Tumorerkrankungen, Transplantationsabstoßungsreaktion und Virusinfektionen zunehmend an Interesse. Zur Charakterisierung dieser spezifischen T-Zellen dienen vornehmlich die alpha-Kette des Interleukin 2 Rezeptors (CD25) und der Transkriptionsfaktor FOXP3. CD25 ist allgemein als Aktivierungsmarker bekannt und kann zur Charakterisierung spezieller T-Zellen nur eingeschränkt genutzt werden. Der Transkriptionsfaktor FOXP3 ist in humanen Zellen aufgrund der transienten FOXP3-Expression und der Existenz weiterer FOXP3-exprimierender T-Zellen ohne suppressorische Fähigkeiten nicht ausschließlich regulatorischen T-Zellen zuzuordnen (43-47). Trotz dieser Ergebnisse in humanen T-Zellen wird in der Maus wiederholt die Relevanz von FoxP3 bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung regulatorischer Fähigkeiten erwähnt und die Suche nach Zielgenen von FoxP3 und Regulationsmechanismen von FoxP3 verstärkt (17, 52-54). Auf der Suche nach einem Regulationsmechanismus des Transkriptionsfaktors wurden in der vorliegenden Arbeit erstmalig die epigenetischen Einflüsse anhand der DNA-Methylierung in der „Treg-specific- demethylation-region“ (TSDR) des foxp3 Gens mit der FOXP3-Expression in unterschiedlich stimulierten naiven T-Zellen verglichen. Ziel der Untersuchungen war es, herauszufinden, inwieweit Änderungen der FOXP3-Expression auf Proteinebene mit epigenetischen Änderungen im DNA- Methylierungsmuster des foxp3 Gens korrelieren, und ob durch diese Ergebnisse eine allgemeingültige Unterscheidung der FOXP3-exprimierenden T-Zellen möglich ist. Zunächst wurden verschiedene Stimulationssysteme miteinander verglichen und die Stimulation mit Antikörper-beschichteten Beads aufgrund einer optimalen Zellaktivierung ausgewählt. Daraufhin konnte mit den Antikörper- beschichteten Beads unter verschiedenen Kulturbedingungen die FOXP3-Expression der stimulierten naiven T-Zellen beeinflusst werden. Jedoch blieb trotz starker FOXP3-Induktion in den unter neutralen Bedingungen, unter Zugabe von TGF-ß oder unter Zugabe von TGF-ß plus IL-2 stimulierten T-Zellen eine Demethylierung in der TSDR des foxp3 Genortes aus. Ausschließlich die ex vivo sortierten CD4+CD25high regulatorischen T-Zellen waren in der analysierten TSDR stark demethyliert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen daher darauf hin, dass mit der DNA-Methylierungsanalyse eine klare Unterscheidung induzierter FOXP3+ T-Zellen von natürlichen regulatorischen T-Zellen möglich ist und zur Identifizierung regulatorischer T-Zellen in humanen T-Zellen diese Methode ein besseres Kriterium als der Transkriptionsmarker FOXP3 darstellt. Unter der weiteren Annahme, dass eine Demethylierung der TSDR im foxp3 Gen mit einer stabilen FOXP3-Expression korreliert, wären stabil FOXP3-exprimierende natürliche regulatorische T-Zellen mit suppressorischen Eigenschaften in der TSDR demethyliert. Induzierte FOXP3+ T-Zellen und transient FOXP3-exprimierende T-Zellen weisen hingegen eine methylierte TSDR auf. Mit diesem Potential zur Bestimmung humaner funktioneller regulatorischer T-Zellen kann diese in der vorliegenden Arbeit vorgestellte Analyse des DNA- Methylierungsmusters im foxp3 Gen in der Diagnostik und bei der Verlaufsbeobachtung sowie als therapeutischer Ansatz in der Onkologie, Transplantationsmedizin, bei Virusinfektionen und bei Autoimmunerkrankungen ihre Anwendung finden.

Regulatory T-cells play a pivotal role in autoimmune diseases, cancer, viral infections and within transplant rejections. So far, these cells have been characterized by CD25 (the alpha-chain of the interleukin 2 receptor) and the transcription factor Foxp3. In human cells, however, FOXP3 does not seem to be a specific marker as results of transient FOXP3 epression and the existence of FOXP3+ T cells without suppressive capacity have shown. But as results in murine cells have proven, FOXP3 does seem to play an important role within the homeostasis of regulatory T-cells and therefore the search for regulating mechanisms of this factors has been intensified. Here, I compared the DNA methylation status of the Treg-specific-demethylation-region (TSDR) within the foxp3 gene with the FOXP3 expression of stimulated naive T-cells. The goal was to see, in how far changes within the FOXP3 expression on the protein level correlate with changes on the epigenetic level as the results of the DNA methylation status might show. Furthermore I wanted to see whether FOXP3-expressing T-cells could be distinguished by the DNA methylation status. The results show that, although a high FOXP3 expression was seen in anti-CD3 /anti-CD28 beads stimulated T cells (and additionally with or without TGF- beta), there were no changes of the DNA methylation status within the foxp3 gene measured. Only the regulatory T cells did show a distinct DNA methylation pattern (demethylation) within the foxp3 gene. Therefore, this method could be used to distinguish FOXP3 expressing human T cells and and shows more specificity for regulatory T cells than the single use of transcription factor FOXP3. Concluding, this method of analysing the DNA methylation status of FOXP3 expressing T cells shows great potential in diagnotics and montoring of autoimmune diseases as well as therapeutic possibilities in fighting cancer, viral infections, transplant rejections and autoimmune diseases.