Molecular identification of the volume-regulated anion channel VRAC by a genome-wide siRNA screen

Abstract

The ability of a cell to adapt to changes in extracellular and intracellular osmolyte concentrations is crucial to its survival. During osmotic challenges, extensive swelling of the cell has to be prevented and is counteracted by a process called regulatory volume decrease. A key player in this process is the volume-regulated anion channel (VRAC), which has been extensively described and characterized by electrophysiological means but the protein(s) composing the channel could not be identified so far. We used a fluorescence-based assay in a genome-wide siRNA screen to identify the gene(s) underlying the ubiquitously observed VRAC current. Subsequent bioinformatics data analysis and manual hit assessment defined candidate genes for a secondary screen using independent siRNA pools. Of these the most prominent effect was yielded by the siRNA pool against LRRC8A. We subsequently confirmed this putative four- transmembrane-domain protein as an essential component of VRAC by electrophysiological measurements in combination with the generation of knockout cell lines for LRRC8A and the four other members of the LRRC8 protein family using the CRISPR/Cas technology. We furthermore investigated the transmembrane topology of LRRC8A and the subcellular localization of all LRRC8 family members. We could show that LRRC8A localizes to the plasma membrane where it forms heteromers with the other members of this protein family and that current kinetics depend on the subunit composition. Finally, we demonstrated that LRRC8A is indispensable for the process of regulatory volume decrease.

Die Fähigkeit einer Zelle, sich an Schwankungen der intrazellulären und extrazellulären Osmolytkonzentration anzupassen, ist unabdingbar für ihr Überleben. Während dieser osmotischen Schwankungen wird dem übermäßigen Anschwellen der Zelle durch den Prozess der regulatorischen Volumenabnahme entgegen gewirkt. Eine Schlüsselfunktion in diesem Prozess nimmt der volumenregulierte Anionenkanal (VRAC) ein, der bereits eingehend anhand von elektrophysiologischen Methoden beschrieben wurde. Die molekulare Identifikation des/der Proteins(e), welches(e) den Kanal bildet(n), ist jedoch bisher nicht gelungen. Wir haben einen fluoreszenzbasierten Assay in einem genomweiten siRNA-Screen verwendet um Gene zu identifizieren, die dem ubiquitär vorhandenen VRAC-Strom zugrunde liegen. Die anschließende bioinformatische Datenanalyse und manuelle Trefferbeurteilung ergab eine Kandidatenliste für den Sekundärscreen, welcher mit unabhängigen siRNA-Pools durchgeführt wurde. Von diesen Kandidaten konnte der deutlichste Effekt mit dem siRNA-Pool für das LRRC8A Gen erzielt werden. Das kodierte Protein LRRC8A, welches vier vorausgesagte Transmembrandomänen besitzt, konnte daraufhin in elektrophysiologischen Messungen sowie anhand von Experimenten in Knockout- Zelllinien, welche mit Hilfe der CRISPR/Cas-Technologie hergestellt wurden, als essentieller Bestandteil von VRAC bestätigt werden. Des Weiteren wurde die Transmembrantopologie von LRRC8A sowie die subzelluläre Lokalisation aller LRRC8-Proteine untersucht. So konnte gezeigt werden, dass LRRC8A in der Plasmamembran vorliegt, wo es mit den anderen Mitgliedern der Proteinfamilie Heteromere bildet, deren Zusammensetzung die Kinetik des VRAC-Stroms beeinflusst. Abschließend konnte gezeigt werden, dass der Prozess der regulatorischen Volumenabnahme von LRRC8A abhängt.