Der Einfluss der beiden cAMP Effektoren, PKA und EPAC, auf die Gedächtnisbildung bei Drosophila melanogaster

Abstract

cAMP ist ein ubiquitärer sekundärer Botenstoff, der mehrerer Effektoren aktiviert und dessen Signalwirkung die synaptische Plastizität während des Lernens und der Gedächtnisbildung moduliert. In Drosophila melanogaster wird bei einer olfaktorischen aversiven Konditionierung ein assoziatives Gedächtnis gebildet, welches einen zeitlich dynamischen Charakter besitzt und aus mehreren unterscheidbaren Gedächtniskomponenten, u.a. dem Kurzzeitgedächtnis (STM) und dem Mittelzeitgedächtnis (MTM) besteht. Das MTM kann durch eine amnestische Behandlung (z.B. einem Kälteschock) in seine zwei koexistierenden Gedächtniskomponenten unterteilt werden, dem Anästhesie-resistenten Gedächtnis (stabiles ARM) und dem Anästhesie-sensitiven Gedächtnis (labiles ASM). Obwohl bereits gezeigt werden konnte, dass die Bildung des olfaktorischen Gedächtnisses durch eine cAMP vermittelte Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) unterstützt wird, sind die zellulären cAMP Signale und die Aktivität der stromabwärts gelegenen PKA während der Bildung der einzelnen Gedächtniskomponenten ungenügend verstanden. Mit der Entdeckung des cAMP Effektors, EPAC (Exchange Protein directly activated by cAMP), konnte neben PKA ein weiterer Effektor identifiziert werden, der ebenfalls einen Einfluss auf die Gedächtnisbildung besitzen könnte. Mit Hilfe genetischer Manipulationen und dem olfaktorischen Konditionierungsparadigma konnte in dieser Arbeit eine funktionelle Zuordnung der beiden cAMP Effektoren, PKA und EPAC, bei der Bildung spezifischer Gedächtniskomponenten aufgezeigt werden. Durch eine graduelle Herunterregulierung der katalytischen Untereinheit von PKA konnte eine komplexe und differenzierte Beteiligung von PKA bei der Bildung des stabilen ARM, des labilen ASM und des STM auf zwei verschiedenen Ebenen ermittelt werden; erstens auf der Ebene der intrazellulären PKA Aktivität und zweitens auf der Ebene der neuronalen Netzwerke. Es zeigte sich, dass für die Bildung der einzelnen Gedächtniskomponenten unterschiedliche PKA Schwellenwerte erforderlich sind. Weiterhin ergab die Analyse eine differenzierte Beteiligung von PKA bei der Bildung des stabilen ARM und des labilen ASM/STM. Während für die Bildung des stabilen ARM eine Beteiligung von PKA in allen Neeuropilen entlang des olfaktorischen Signalweges benötigt wird, d.h. in den Antennalloben (ALs) und in den Kenyonzellen (KCs) der einzelnen Subtypen der Pilzkörper (MBs), ist für die Bildung des labilen ASM/ STM eine PKA Funktion ausschließlich in den KC Subtypen der MBs erforderlich. Allerdings scheint jedoch innerhalb des KC-Subsystems eine unterschiedliche Beteiligung von PKA bei der Bildung des labilen ASM/STM und des stabilen ARM vorhanden zu sein. Durch die Analyse von Tomosyn, einem stromabwärts gelegenen Zielsubstrat von PKA, konnte eine weitere funktionelle Unterscheidung von PKA innerhalb der KCs der einzelnen Subtypen bei der Bildung des STM und des labilen ASM ermittelt werden. Die Ergebnisse deuten auf drei unterschiedliche PKA abhängige Signale hin, die auf der Ebene der KCs aktivitätsabhängig agieren und spezifisch die Bildung der einzelnen Gedächtniskomponenten (STM, ASM, ARM) unterstützen, indem sie beispielsweise unterschiedliche synaptische Proteine phosphorylieren. Eine Manipulation von EPAC zeigte eine Beteiligung bei der Bildung des labilen ASM und des STM innerhalb der einzelnen KC Subtypen der MBs. Somit konnte gezeigt werden, dass neben der PKA ein weiterer direkter cAMP Effektor eine Funktion bei der Bildung dieser spezifischen Gedächtniskomponenten besitzt. Im Gegensatz zu PKA werden Epac Signale jedoch in den KCs der einzelnen Subtypen der MBs für die Bildung des labilen ASM/STM benötigt, während PKA Signale funktionell redundant innerhalb der KCs der MBs agieren. Diese Befunde deuten darauf hin, dass die Bildung des labilen ASM und des STM wesentlich komplexer zu sein scheint, als bisher vermutet. Scheinbar wird die Bildung dieser Gedächtniskomponenten durch mehrere unabhängige cAMP Signalwege moduliert, die subzellulär und innerhalb neuronaler Netzwerke voneinander dissoziiert werden können.

The ubiquitous second messenger cAMP is involved in synaptic plasticity by activating several downstream effectors during learning and memory formation. In Drosophila melanogaster, olfactory aversive conditioning leads to an associative memory which consists of several different temporal components including short-term memory (STM) and middle-term memory (MTM). MTM can be further divided by amnesic treatments (e.g. cold shock) into its two coexisting components – anaesthesia-resistant memory (stable ARM) and anaesthesiasensitive memory (labile ASM). Although it has been demonstrated that cAMP dependent activation of PKA supports memory formation, the precise involvement of cellular cAMP signaling and PKA activity during formation of different memory components still remain unclear. However, with the discovery of another major target of cAMP known as EPAC (Exchange Protein directly activated by cAMP), there may be more than one cAMP sensor involved in memory formation. This issue was addressed by use of genetic manipulation and the olfactory conditioning paradigm, providing a functional assignment of both cAMP effectors, PKA and EPAC, during formation of specific memory components. Progressive knockdown of PKA catalytic subunit revealed a complex participation of PKA during the specific formation of stable ARM, labile ASM and STM that can be distinguished at two levels: first at the level of intracellular activity and second, at the level of neuronal circuitry. Thereby, it was shown that formation of distinct memory components requires different thresholds of PKA. Furthermore, this study revealed a general distinction between PKA signaling required for either stable ARM or labile ASM/STM. While formation of stable ARM depends on PKA signaling within different brain structures of the olfactory pathway, e.g. the antennal lobes (ALs) and the Kenyon cell (KCs) subtypes of the mushroom bodies (MBs), formation of labile ASM/STM solely relies on PKA signaling within the KC subtypes of the MBs. However, the involvement of PKA signaling within the single KC subtypes in labile ASM/STM formation differs from that of stabile ARM formation. Furthermore, by analyzing the PKA downstream target tomosyn, it could be shown that the involvement of PKA signaling within the single KC subtypes differs between STM and labile ASM. These findings indicate that three different types of activity dependent PKA signals intersect at the level of KCs to support formation of specific memory components (STM, ASM and ARM) i.e. by phosphorylation of different sets of synaptic proteins. In addition, the analysis of EPAC revealed an involvement specifically during formation of labile ASM and STM within the single types of KCs. Hence, it could be shown that beside PKA another cAMP sensor is directly involved in formation of those memory components. In contrast, EPAC signaling is required within the single subtypes of the KCs, while PKA signaling seems to be functionally redundant within the different KC network. These findings indicate that formation of labile ASM and STM seems to be much more complex as originally thought. Apparently, formation of those memory components is modulated by different independent cAMP signaling pathways, which dissociate from each other on a cellular and a neuronal circuitry level.