Leishmania tropica: molecular epidemiology, diagnosis and development of an axenic amastigote model

Abstract

Cutaneous Leishmaniasis (CL), or oriental sore, is mainly caused by Leishmania tropica and L. major in the Old World. CL due to L. tropica has become a major public health problem in different endemic foci due to recent outbreaks in several urban areas. The disease caused by L. tropica presents varying clinical manifestations and complications. These parasites may differ in drug susceptibility, vector and animal host specificities, and show considerable genetic heterogeneity. In this study, a new diagnostic method was developed for the identification of Leishmania parasites which is based on the amplification of the ribosomal internal transcribed spacer 1 (ITS1) region followed by hybridization with species-specific probes and colorimetric detection of the hybrids (ITS1-Reverse line blot hybridization (RLB)). Using 3 species-specific probes for L. tropica, we were able to differentiate this parasite from the other species present in the Middle East, L. infantum and L. major, both of which co-exist with L. tropica. The assay was 10- to 100-fold more sensitive compared to previously used detection of PCR products on gels. The Leishmania RLB was used to diagnose samples from suspected CL patients in Israel and the Palestinian areas. In addition, the geographical distribution of L. tropica parasites was investigated in Israel, Palestine, Turkey and Morocco using the ITS1-restriction fragment length polymorphism (RFLP). This parasite was shown to cause human disease in > 15 foci in Israel and Palestine, 6/10 localities in Turkey, and in 3/6 regions investigated in Morocco. To facilitate further studies on the intracellular amastigote form of L. tropica, conditions to grow axenic amastigotes were developed. Different techniques including light microscopy, macrophage infection, stage-specific antigen expression and differential display were used to characterize the L. tropica axenic amastigotes and compare them with the promastigote stage that resides in the sand fly vector, and with tissue amastigotes that were obtained from infected macrophages. We were able to demonstrate that pH of 5.5 and temperature 36oC were most suitable for generating and maintaining long term cultures of axenic amastigotes (AxA). These AxA were morphologically similar to tissue amastigotes and > 15-fold more infective than stationary phase promastigotes. Western blot analysis showed that promastigote-specific monoclonal antibodies to lipophosphoglycan or flagella antigen were either absent or poorly expressed in AxA, while an amastigote-specific antibody reacted strongly with the AxA. Differential display – PCR analysis used to examine stage specific gene expression detected amastin a gene normally expressed by amastigotes. Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) was used to compare the expression of several genes in promastigotes, AxA and tissue amastigotes. The expression of cysteine protease B (cpb) and amastin genes, both highly expressed in tissue amastigotes and AxA, was down-regulated or absent, respectively, in promastigotes. Conversely, the gene for protein kinase A catalytic subunit isoform 1 (pkac1), a promastigote stage specific gene, was strongly expressed by the extracellular stage of the parasite and not expressed by AxA or tissue amastigotes. AxA of L. tropica will be useful for high-throughput screening of new drugs as well as for studies on parasite differentiation, gene regulation and metabolism.

Die kutane Leishmaniose (CL), oder Orientbeule, wird in der Alten Welt meist durch Leishmania tropica und L. major hervorgerufen. Erkrankungen bedingt durch L. tropica sind in letzter Zeit durch Ausbrüche in mehreren urbanen Regioene zu einem wichtigen Gesundheitsproblem in verschiedenen Endemiegebieten geworden. Die durch L. tropica hervorgerufenen Erkrankungen zeichnen sich durch variierende klinische Manifestationen und Komplikationen aus. Die Parasiten können sich in ihrer Suszeptibiltät gegenüber verschiedenen Therapeutika sowie ihrer Spezifität gegenüber Vektoren und tierischen Wirten unterscheiden und sind genetisch sehr heterogen. In dieser Arbeit wurde eine neue diagnostische Methode für die Identifizierung von Leishmania-Parasiten entwickelt, die auf der Amplifizierung des ribosomalen „internal transcribed spacer 1 (ITS1)“mit anschließender Hybridisierung an spezies-spezifische Sonden und kolorimetrischer Detektion der Hybride beruht (ITS1-Reverse line blot hybridization (RLB)). Durch die Verwendung von 3 spezies-spezifischen Sonden für L. tropica,konnten wir diesen Parasit von den anderen im Mittleren Osten vorkommenden Spezies, L. infantum and L. major, unterscheiden, die beide mit L. tropica koexistieren. Die Methode war 10- bis 100-fach empfindlicher als der früher angewendete Nachweis der PCR-Produkte im Gel. Der Leishmania- RLB-Test wurde für die Diagnostik bei israelischen und palästinensischen Patienten mit Verdacht auf CL eingesetzt. Zusätzlich wurde die geographische Ausbreitung der L. tropica-Parasiten in Israel, Palästina, der Türkei und Marokko mit Hilfe von ITS1-Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP) untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass dieser Parasit Erkrankungen des Menschen in > 15 israelischen und palästinensischen Foci, in 6/10 Orten in der Türkei und in 3/6 untersuchten Regionen in Marokko hervorruft. Für zukünftige Studien an dem intrazellulären Stadium (amastigote Form) von L. tropica wurden Bedingungen für die Anzucht axenischer Amastigoten entwickelt. Verschiedene Techniken, wie Lichtmikroskopie, Makrophageninfektion, stadien-spezifische Antigenexpression und der “differential display”, wurden benutzt, um die axenischen Amastigoten von L. tropica zu charakterisieren und mit den Promastigoten, die im Sandmückenvektor vorkommen, und den Gewebeamastigoten, die in infizierten Makrophagen zu finden sind, zu vergleichen. Wir konnten zeigen, dass ein pH von 5.5 und eine Temperatur von 36oC für die Herstellung und Erhaltung von Langzeitkulturen axenischer Amastigoten (AxA) am besten geeignet sind. So erhaltene AxA waren den Gewebeamastigoten morphologisch ähnlich und > 15-fach infectiöser als Stationäre-Phase-Promastigoten. Western- blot-Analysen ergaben, dass Promastigoten-spezifische monoklonale Antikörper für Lipophosphoglykan oder ein Flagella-Antigen in AxA entweder fehlten oder nur schwach exprimiert waren während ein amastigoten-spezifischer Antikörper stark mit den AxA reagierte. Die „differential display – PCR”-Analyse, die für die Untersuchung der stadienspezifischen Genexpression angewandt wurde, wies in den AxA die Expression eines normalerweise Amastigoten-spezifischen Proteins, des Amastin, nach. Mit Hilfe der „reverse transcriptase“ PCR (RT- PCR) wurde die Expresssion verschiedene Gene in Promastigoten, AxA und Gewebeamastigoten verglichen. Die Expression der Gene für die Cysteinprotease B (cpb) und Amastin, beide stark in Gewebeamastigoten und AxA exprimiert, war in Promastigoten herab reguliert oder nicht nachweisbar. Umgekehrt wurde das Gen für die katalytische Untereinheit Isoform 1 der Proteinkinase A (pkac1), welches ein Promastigoten-spezifisches Gen ist, durch das extrazellulären Stadium des Parasiten stark exprimiert und nicht durch AxA oder Gewebeamastigoten. AxA von L. tropica können für ein “high-throughput screening” neuer Medikamente sowie auch für Untersuchungen zur Differenzierung, zur Genregulation und zum Metabolismus der Parasiten eingesetzt werden.