Tissue Engineering von Lungengewebe: Kultur von Alveolarepithelzellen in biokompatiblen Polymerkonstrukten mit integrierten Gefäßsystemen

Abstract

Der Verlust von Gewebe oder der Ausfall eines Organs und ein zunehmender Mangel an Spenderorganen für die Transplantation ist Motivation für die Entwicklung neuer Therapiestrategien. Beim tissue engineering handelt es sich um einen interdisziplinären Ansatz, durch Imitation der Natur einen lebenden Gewebsersatz aus autologen Zellen und biologischen oder synthetischen Polymeren herzustellen, der in den Organismus des Patienten integriert wird und die Funktion des ausgefallenen Gewebes ersetzt. Das tissue engineering von dreidimensionalen Geweben und komplexen Organen wird durch die fehlende Nährstoffversorgung im Inneren des Konstruktes limitiert. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem tissue engineering von funktionalem, biokompatiblem Lungengewebe. In einem ersten Schritt wird ein Polymerkonstrukt aus polydimethylsiloxan und polycarbonate entwickelt, in das ein kapilläres Gefäßsystem integriert ist, über welches die Versorgung des Gewebes mit Nährstoffen und Sauerstoff erfolgen soll. Dieses neue, zweischichtige Polymerkonstrukt besteht aus einer parenchymalen Kammer, die durch eine poröse Membran vom angrenzenden fein verzweigten Gefäßsystem getrennt ist. Das Design für das Gefäßsystem wurde mit einem speziellen Computerprogramm entworfen, das die Perfusion von Kapillaren mit Blut simuliert, und mit Hilfe softlithographischer Verfahren in das Polymer übertragen. Als Modell für Typ II Pneumozyten werden immortalisierte Alveolarepithelzellen der Maus (MLE-12) verwendet. Um die Zellen innerhalb der Polymerkonstrukte sichtbar zu machen, werden diese durch virale Transfektion mit einem grün fluoreszierenden Protein markiert. Die Zellen werden dynamisch auf der Oberfläche von Mikrosphären kultiviert und ohne die Verwendung von Trypsin in die parenchymale Kammer der Polymerkonstrukte überführt. Zur Konditionierung wird das Gefäßsystem während des Versuchszeitraums von 7 Tagen kontinuierlich mit Zellkulturmedium perfundiert. Im Anschluss erfolgt die Analyse der Polymerkonstrukte. Hierbei zeigt sich die Proliferation Zellen von der Oberfläche der Mikrosphären zu einem konfluenten Zellrasen innerhalb der Polymerkonstrukte. Die Vitalität der Zellen ist größer 95 %. Als charakteristische Marker für Typ II Zellen können die Surfactant assoziierten Proteine SP-B und SP-C nachgewiesen werden. Zusammenfassend kann in dieser Arbeit die erfolgreiche Kultivierung funktionaler Alveolarepithelzellen in einem zweischichtigen Polymerkonstrukt gezeigt werden, in dem eine Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff über ein nach physiologischen Maßgaben entworfenes Gefäßsystem erfolgt. Mit der Verwendung von Mikrosphären für den Zelltransfer in die Polymerkonstrukte wurde eine einfache Besiedelungsmethode entwickelt, bei der anstelle einer Einzelzellsuspension fest adhärente und organisierte Zellpopulationen in toto besiedelt werden. Diese Ergebnisse sind erste ermutigende Schritte auf dem Weg der Herstellung von funktionalem Lungengewebe durch tissue engineering und können auch bei der Entwicklung anderer komplexer Organe Anwendung finden.

The increasing shortage of donor organs for transplantation illustrates the need for new strategies in organ replacement therapy. Tissue engineering represents an innovative approach to create a viable and functional tissue substitute from autologous tissue specific cells and biological or synthetic polymers that restores or improve tissue function. Satisfactory vascularization to meet the metabolic needs for oxygen, nutrients and waste removal remains the critical obstacle to overcome for the fabrication of three-dimensional tissue or complex vital organs. This work focuses on tissue engineering of a functional biocompatible lung device. In a first step a microfabricated vascular supply in polydimethylsiloxane is developed, that allows to meet the metabolic requirements for tissue engineering of complex parenchymal organs. The novel dual-layered device provides a parenchymal compartment adjacent to a fractal microvascular network, separated by a porous polycarbonate membrane. The vasculature was designed with a computational algorithm for the simulation of blood flow in microvascular structures and transferred into polydimethylsiloxane by microfabrication technologies. Immortalized murine lung epithelial cells (MLE-12) are used as a model for type II pneumocytes. To visualize the cells within the dual-layered devices, they are transfected with a GFP virus. The cells are dynamically cultured on the surface of polystyrene microcarrier beads and injected into the parenchymal chamber of the dual-layered devices without the use of trypsin. A flow of cell culture medium is established through the vascular compartment and the constructs are maintained in culture for 1 week, after which time they were analyzed. Consistent MLE-12 cell proliferation from the surface of the microcarriers onto the polycarbonate membrane can be shown, where they reach confluency in the greater part of the compartment. A DNA assay is employed to evaluate the cell proliferation over the experimental period. Using a Live/Dead assay the cell viability is determined to be over 95 % at one week throughout the parenchymal compartment. Functional immunostaining shows the presence of the surfactant associated proteins SP-B and SP-C and scanning electron micrographs depict the cells on the surface of the microcarriers and the polycarbonate membrane. In this work, the successful cultivation of functional cells derived from mouse alveolar epithelium is shown in microfabricated polymeric constructs that allow the exchange of nutrients, oxygen and waste through a microvascular network mimicking the physiological vascular structure of an organ. By using microcarrier beads for cell seeding, a novel and straightforward seeding procedure for tissue engineering was developed that allows the seeding of well attached cell clusters instead of single cell suspensions. These results represent encouraging steps toward the development of a functional tissue engineered lung and may also be applicable to further fabrication of complex parenchymal organs.