Das SH-Protein des Mumpsvirus inhibiert die Aktivierung des NF-κB-Signalwegs durch die Interaktion mit den TNFR1-, IL-1R1- und TLR3-Rezeptorkomplexen

Abstract

Das Mumpsvirus kodiert für ein SH-Protein, dessen Einfluss auf die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB in dieser Arbeit untersucht wurde. Da NF-κB ein Hauptregulator der angeborenen Immunantwort ist, haben Viren Strategien entwickelt, um die Aktivierung dieses Transkriptionsfaktors zu behindern und damit die Zeit für die Replikation im Wirtsorganismus zu verlängern. Mit Hilfe rekombinanter Viren kann die Auswirkung eines einzelnen Proteins im Kontext einer Infektion analysiert werden. Bisher sind alle Studien, die die Funktion des SH-Proteins beschreiben, auf Grundlage von Viren durchgeführt worden, bei denen das komplette SH-Gen deletiert wurde. Da die effiziente Replikation von Paramyxoviren vom Gradienten der viralen mRNAs abhängt, ist eine Auswirkung auf die Virulenz und Pathogenität durch die Deletion eines Gens nicht auszuschließen. In dieser Arbeit wurden daher rMuV untersucht, bei denen die Expression des SH-Proteins durch das Einfügen von drei Stoppkodons in das SH- Gen unterdrückt ist oder das SH-Protein durch ein eingefügtes FLAG-Epitop nachgewiesen werden kann. Diese rekombinanten Viren zeigen unabhängig von der Expression des SH-Proteins eine vergleichbare Replikation sowie einen ähnlichen CPE in der Zellkultur. Zum ersten Mal konnte für das SH-Protein die Orientierung in der Plasmamembran infizierter Zellen als die eines Typ-I-Membranproteins bestimmt werden. Die durch das SH-Protein reduzierte Phosphorylierung von IKKβ, IκBα und p65 in rMuV-infizierten Zellen zeigt, dass für die Hochregulation der NF-κB-Aktivierung nicht die Veränderung der Genomstruktur, sondern die verhinderte Expression des SH-Proteins verantwortlich ist. Die Analyse der Phosphorylierung dieser Komponenten dient als Indikator für die Aktivierung von NF-κB, wie auch die Translokation der NF-κB-Untereinheit p65 in den Zellkern, die ebenso in der Gegenwart des SH- Proteins reduziert ist. Ein entscheidender Schritt für die Aufklärung des Mechanismus dieser Reduktion ist der Befund, dass nicht nur die bereits bekannte TNFα-, sondern auch die poly(I:C)- und IL-1β-vermittelte NF-κB- Aktivierung durch die Expression des SH-Proteins um den gleichen Faktor reduziert sind und daher die NF-κB-Aktivierung durch das SH-Protein nicht nur mittels der Signalübertragung eines einzigen zellulären Rezeptors inhibiert wird. Die Ebene, auf der die Beeinflussung vermittelt wird, wurde in weiteren Experimenten auf die der Rezeptorkomplexe eingeschränkt. Die Interaktion des SH-Proteins wurde mit den Rezeptoren TNFR1 und TLR3 sowie den früh rekrutierten Adapterproteinen RIP1 und IRAK1 gezeigt. Zusammen führen diese Ergebnisse zu der Vermutung, dass das SH-Protein mit den TNFR1-, TLR3- und IL- 1R1-Rezeptorkomplexen in der Plasmamembran infizierter Zellen interagiert und diese Interaktion in der Reduktion der NF-κB-Aktivierung resultiert. Eine direkte Auswirkung der reduzierten Aktivierung von NF-κB auf die Induktion der Immunantwort wurde durch die Reduktion der Genexpression sowie der Freisetzung der pro-inflammatorischen Zytokine TNFα und IL-1β durch das Vorhandensein des SH-Proteins in rMuV-infizierten Makrophagen gezeigt. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass dem SH-Protein von MuV die Funktion eines Virulenzfaktors zugesprochen werden kann, der durch die Inhibition der NF-κB- Aktivierung für eine verzögerte Immunantwort und damit für eine ausreichende Zeitspanne zur Vervielfältigung der MuV Partikel sorgt.

Similar to several other paramyxoviruses, the mumps virus also encodes for a SH protein. In this work, the impact of SH on the activation of the transcription factor NF-κB was analyzed. Since NF-κB is a major regulator of the innate immune response, numerous viruses have developed strategies to interfere with the activation of this transcription factor, thereby prolonging the timespan for replication in the host organism. Using recombinant viruses, the impact of a single protein on this interference can be analyzed in the context of an infection. However, all studies describing the function of the SH protein so far were performed with viruses in which the complete SH gene was deleted. Since the efficient replication of paramyxoviruses depends on the gradient of viral mRNAs, which is determined by the number and order of the viral genes, the deletion of a complete gene may affect virulence and pathogenicity. Therefore, in this work rMuVs were analyzed, in which the expression of the SH protein is suppressed by the insertion of three stop codons into the SH gene or the SH protein can be detected in infected cells due to an inserted FLAG-epitope. These recombinant viruses exhibit a comparable replication and a similar CPE in tissue culture independent of the expression of SH. For the first time, the orientation of the SH protein in the plasma membrane of infected cells was determined as that of a type I membrane protein. SH reduces the phosphorylation of IKKβ, IκBα, and p65 in rMuV- infected cells, showing that not the modification of the genomic structure but the prevented expression of SH is responsible for the upregulation of the NF- κB pathway. The analysis of the phosphorylation of the examined pathway components serves as an indicator for NF-κB activation. Likewise the analysis of the translocation of the NF-κB subunit p65 into the nucleus does, which is as well reduced in the presence of SH. A crucial step in the elucidation of the underlying mechanism is the finding that not only the already known TNFα-, but also the poly(I:C)- and IL-1β-mediated NF-κB activation is reduced by the same magnitude due to the expression of SH. Therefore, the activation of NF-κB by the SH protein is not inhibited via signal transduction of a single but via several cellular receptors. In further experiments, the level at which SH impedes NF-κB signaling was restricted to the level of the receptor complexes. Moreover, the interaction of SH with the receptors TNFR1 and TLR3, as well as with the early recruited adaptor proteins RIP1 and IRAK1, was shown. Together, these results suggest that the SH protein interacts with the receptor complexes of TNFR1, TLR3, and IL-1R1 in the plasma membrane of infected cells and that this interaction leads to the reduction of the NF-κB activation. A direct impact of the reduced activation of NF-κB on the induction of immune responses was shown by the reduction of gene expression and release of the pro-inflammatory cytokines TNFα and IL-1β in the presence of SH in rMuV- infected macrophages. In contrast, neither the gene expression nor the release of IL-18 is induced due to infection with MuV in the analyzed cell line. Taken together, the results of this work show that the MuV SH protein functions as a virulence factor, by delaying innate immune response and thereby providing time for the replication of MuV particles via the inhibition of the NF-κB activation.