In vitro Testsysteme zur Detektion des sensibilisierenden Potentials von Substanzen: Untersuchungen über die Funktion von PD-L1 bei Interaktionen von Dendritischen Zellen mit T-Zellen

Abstract

Mit dem Ziel, die Entwicklung neuer immunologischer in vitro Testsysteme für die Evaluierung potentiell human sensibilisierender Substanzen voranzutreiben, wurden neuartige funktionelle Zellkultursysteme entwickelt, welche sowohl zelluläre und als auch molekulare Ereignisse bei der Entstehung einer humanen Kontaktallergie widerspiegeln. Da beide, sowohl antigenpräsentierende Dendritische Zellen (DC) als auch T-Zellen die humane Immunantwort der allergische Kontaktdermatitis maßgeblich determinieren, wurden beide Zelltypen in die Untersuchungen einbezogen. Im ersten Teil der vorliegenden Dissertation wurden molekulare Reaktionen von primären antigenpräsentierenden mit Zellen (APC) und DC-ähnlichen Zelllinien auf sensibilisierende Substanzen hin untersucht. Dabei konnte erstmalig in primären humanen DC eine signifikante allergenabhängige Regulation von programmed death-ligand 1 (PD-L1), DC immunoreceptor (DCIR), Interleukin-16 (IL-16) und neutrophil-activating protein-2 (NAP-2) detektiert werden. Als neue potentielle Biomarker wurden diese mit den bereits für allergenspezifische in vitro Reaktionen gut charakterisierten Markern CD86 und IL-8 verglichen. Um die Eignung von DC- ähnlichen Zelllinien für in vitro Testsysteme zur Detektion von Kontaktallergenen zu überprüfen, wurde die Expression dieser Marker zwischen den primären MoLC (aus Monozyten generierte Langerhans Zellen) und MoDC (aus Monozyten generierte DC) sowie den Zelllinien MUTZ-3 und THP-1 verglichen. Abhängig vom Zelltyp konnte gezeigt werden, dass die reziprok regulierten Oberflächenproteine PD-L1 (+) und DCIR (-) sowie die Zytokine MIP-1α, NAP-2 und IL-16 als neue Marker für ein sensibilisierendes Potential genutzt werden können. Phänotyp und Funktion unterschieden sich erwartungsgemäß deutlich zwischen primären DC und den untersuchten DC-ähnlichen Zelllinien. Aufgrund der höheren absoluten Expressionswerte, als auch der größeren dynamische Bandbreite der ermittelten Markerexpression, erwiesen sich die humanen MoDC als am besten geeignet für die in vitro Testung und Identifizierung humaner Kontaktallergene. Da die T-Zellantwort in der allergischen Kontaktdermatitis, Typ IV Allergie, eine zentrale Rolle einnimmt, sollte sich der zweite Teil der Arbeit auf die durch Kontaktallergene induzierte zelluläre und molekulare T-Zellantwort fokussieren. So sollte hier die Wirkung des instruierenden inhibitorischen Signals von programmed death-ligand 1 (PD-L1) in der akuten Phase der Kontaktallergie untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass PD-L1 sowohl auf in vitro generierten Langerhans-Zellen als auch in der Haut von Nickelallergikern nach Exposition mit Nickel, einem der klinisch bedeutsamsten Kontaktallergene, stark erhöht ist. Mittels blockierender Antikörper, welche die Interaktion zwischen PD-L1 und den entsprechenden Rezeptoren auf der T-Zelle verhindern, konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung von T-Helfer-Zell-spezifischen Zytokinen sowohl von der Aktivierung der Langerhans-Zellen als auch von der PD-L1- PD-1 Interaktion abhängig ist. Die Blockierung von PD-L1 auf Nickel stimulierten MoLC führte zu einer stark erhöhten Freisetzung von TNF-α und IL- 22 aus kokultivierten, allogenen T-Helfer Zellen. Untersuchungen einer weiteren speziellen T-Zell Subpopulation, der CCR6+/CCR4+ T Gedächtniszellen, ergaben, dass diese nach Kokultur mit Nickel stimulierten MoLC und zusätzlicher Inhibition von PD-L1, die Zytokine IL-17 und IFN-γ sezernierten. Diese Ergebnisse deuten auf eine entscheidende Rolle von PD-L1 bei der Kontrolle der inflammatorischen Immunantwort im Verlauf der allergischen Kontaktdermatitis hin. Aus diesem Teil der Dissertationsarbeit könnten sich neuartige therapeutische Ansätze für die Behandlung der humanen Kontaktallergie ergeben, wie z.B. durch den Einsatz PD-L1 induzierender Stimuli oder synthetischer PD-L1 Analoga.

In order to develop new immunological in vitro test systems suitable for the detection of allergenic chemicals, there is a need for appropriate cell culture systems that depict cellular and immunological events involved in allergic contact dermatitis. Since Dendritic cells (DC) as well as T-cells determine the course of the immune reaction in allergic contact dermatitis, both cell types were investigated in this work. In the first part of this study we determined the influence of sensitizing chemicals on primary antigen presenting cells and DC-like cell lines. We identified the potential biomarkers programmed death-ligand 1 (PD-L1), DC immunoreceptor (DCIR), Interleukin (IL) -16, and neutrophil-activatingprotein- 2 (NAP-2), all of which were detectable in primary human DC upon exposure to chemical contact allergens. These molecules were compared to the performance of the well- established markers CD86 and IL-8. To test the applicability of DC-like cell lines for the testing of compounds in in vitro test systems, we compared the performance of the potential new biomarkers on MoLC (monocyte derived Langerhans cells) and MoDC (monocyte derived Dendritic cells) as well as on the MUTZ-3 and THP-1 cell line. It was shown that depending on the cell type the reciprocally regulated surface proteins PD-L1 (+) and DCIR (-) as well as the cytokines MIP-1α, NAP-2 and IL-16 can serve as new markers for the detection of a chemical’s sensitizing potential. As expected, primary cells were clearly different in phenotype and function compared to the DC-like cell lines. Therefore, due to higher absolute values and a broader dynamic range in biomarker expression, primary cells seem to be the method of choice for in vitro identification of contact allergens. As the allergen specific T-cell reaction plays a central role in allergic contact dermatitis, Type IV allergies, the second part of the work focused on the cellular and molecular events in the T-cell response induced by contact allergens. With the aim of establishing a novel, predictive and robust in vitro test system, the effect of the dominant inhibitory signaling molecule, namely PD-L1, was to be addressed. In this thesis, for the first time upregulation of PD-L1 after exposure to nickel, one of the most prominent contact allergens, could be demonstrated on in vitro generated Langerhans Cells as well as in skin biopsies of patients allergic to nickel. By using antibodies able to inhibit the interaction of PD-L1 and the corresponding receptors on the T-cells it could be shown that the release of T-helper cell specific cytokines is dependent on both stimulation of LCs and inhibition of PD-L1–PD-1 interactions. Blockage of PD-L1 on nickel stimulated MoLCs resulted in increased release of TNF-α and IL-22 from co-cultured, allogenic T-helper cells. Further examination of the CCR6+/CCR4+ T-memory cell subpopulation, revealed that these cells showed enhanced secretion of IL-17 and IFN-γ after co-cultivation with nickel stimulated MoLC and blockage of PD-L1. These findings suggest a crucial role of PD-L1 in the control of the inflammatory immune reaction in contact dermatitis. This knowledge may set the course for the development of new therapies in the treatment of contact dermatitis by using PD-L1 inducing stimuli or synthetic PD-L1 analogs.