Die Bedeutung der Angiopoietine-1 und -2 und ihres Rezeptors Tie2 in der Pneumokokkenpneumonie

Abstract

Trotz einer adäquaten antimikrobiellen Therapie kommt es bei einer Pneumonie häufig zu überschießenden Entzündungsreaktionen und endothelialer Hyperpermeabilität, was zu akutem Lungenversagen und Tod führen kann. Der Grund hierfür liegt zumeist in einer inadäquaten Pathogen-Wirts-Interaktion. Eine Therapie des akuten Lungenversagens ist derzeit nur supportiv möglich. Zur Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten und zur frühzeitigen Identifikation von Risikopatienten mit erhöhter Mortalität ist ein tieferes Verständnis der zugrundeliegenden Pathomechanismen bei der Pneumonie unverzichtbar. Ang-1 und Ang-2 sind Liganden der Rezeptortyrosinkinase Tie2 mit weitreichender Bedeutung für die Angiogenese und Tumorvaskularisation. Weiterhin sind sie an der Entstehung von endothelialer Permeabilität und Inflammation zentral beteiligt, denn Ang-1 erzeugt durch Tie2-Aktivierung ein inaktives, ruhendes Endothel, wohingegen Ang-2 als kompetitiver Antagonist Endothelaktivierung, erhöhte Permeabilität und eine Initiierung von Entzündungskaskaden bewirkt. Es wird u.a. durch inflammatorische Stimuli aus den endothelialen Weibel-Palade bodies frei gesetzt. Es wurde bereits gezeigt, dass bei Sepsis und insbesondere bei Sepsis mit Lungenversagen die Ang-2-Konzentration im Blut und das Ang-2/Ang-1-Verhältnis erhöht sind. Die Rolle des Ang/Tie2-Systems in der schweren Pneumonie wurde bisher noch nicht untersucht. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Bedeutung des Ang/Tie2-Systems in der Pneumokokkenpneumonie zu untersuchen und zu evaluieren, ob Ang-2 als möglicher Biomarker zur Risikostratifizierung bei der schweren Pneumonie geeignet ist. In differenziellen experimentellen Ansätzen auf unterschiedlicher Komplexebene sollte die Rolle des Ang/Tie2-Systems beim Pneumonie-induzierten akuten Lungenversagen und sein Potential für mögliche therapeutische Ansätze geprüft werden. In einer initialen Messung wurden verringerte Ang-1- und erhöhte Ang-2-Serumkonzentrationen bei Pneumoniepatienten im Vergleich zu gesunden Blutspendern ermittelt (n = 20). In einer nachfolgenden Studie konnten diese Ergebnisse verifiziert werden. Weiterhin zeigte sich hier ein signifikanter Unterschied in der Ang-2-Serumkonzentration zwischen Pneumoniepatienten mit letalem (innerhalb von 28 Tagen verstorben, n = 64) vs. nichtletalem (n = 64) Verlauf. Dieser Unterschied konnte jedoch bei einer Wiederholungsstudie (n = 74 pro Gruppe) zur Prüfung der statistischen Validität der bereits erhobenen Ergebnisse nicht bestätigt werden. Für Rückschlüsse auf die Dynamik des Ang/Tie2-Systems wurden Serumproben (VALID Studie) von Patienten mit einem Pneumonie-induziertem ARDS zu drei verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf der intensivmedizinischen Behandlung untersucht (n = 38). Zu den Zeitpunkten 0 h und 24 h nach Aufnahme auf die Intensivstation wurden erhöhte Ang-2- und verringerte Ang-1-Serumkonzentrationen im Vergleich zu gesunden Blutspender-kontrollen gemessen. Patienten, die das ARDS überlebten, hatten sieben Tage nach dem intensivmedizinischen Behandlungsbeginn nahezu normale Ang-1- und Ang-2-Werte. Um weitere Aussagen über die Kinetik der Ang-2-Freisetzung bei einer akuten Inflammation treffen zu können, wurden in einer prospektiven Studie Blutproben von Läufern des Berlin-Marathons (n = 18, Studie RUNINFLAME) auf verschiedene Entzündungsparameter hin untersucht, da ein Marathonlauf als ein proinflammatorischer Stimulus auf den Körper zu wirken scheint. Der CRP-Wert aller Läufer stieg erst 24 h nach dem Lauf an. Die Ang-2-Serumkonzentration war hingegen unmittelbar nach dem Lauf erhöht und sank 24 h später wieder auf die Ausgangskonzentrationen ab. Ang-2 könnte somit ein sehr frühzeitiger Marker für Inflammation sein. Zur Lokalisation von Ang-1, Ang-2 und ihres Rezeptors Tie2 in der Lunge wurden Lungenproben von gesunden und an Pneumonie erkrankten Menschen immunhistochemisch untersucht. Dabei zeigte sich, dass Ang-1 von verschiedenen Zelltypen exprimiert wurde, wohingegen eine Ang-2- und Tie2-Expression ausschließlich in Endothelzellen detektiert wurde. In vitro konnte beobachtet werden, dass eine Pneumolysinstimulation (PLY) zu einer Ang-2-Freisetzung aus Endothelzellen (HUVECs) führte, nicht aber zu einer Freisetzung von IL-6. Eine Stimulation von HUVECs mit Ang-2 bewirkte bei der höchsten Konzentration einen kurzen, reversiblen Permeabilitätsanstieg. Zur Ermittlung einer möglichen Beteiligung von Ang-2 an der PLY-induzierten pulmonalen Permeabilität wurden Mäuse mit spezifischer siRNA gegen Ang-2 (Atuplex) behandelt und anschließend ihre isolierten, perfundierten und ventilierten Lungen (IPML) mit PLY stimuliert. Diese siRNA-Vorbehandlung führte zu einer Reduktion der PLY-induzierten alveolokapillären Barrierestörung. Abschließend wurde die Rolle des Ang/Tie2-Systems in vivo im Modell der murinen Pneumokokkenpneumonie untersucht. Die pulmonale Ang-2-mRNA- Expression stieg im Pneumonieverlauf an, während die von Ang-1 und Tie2 reduziert war. Eine Ang-1-Therapie, beginnend 22 h nach einer Infektion mit S. pneumoniae, führte bei den Tieren zu einer verminderten Zytokinfreisetzung, verringerter Rekrutierung neutrophiler Granulozyten und einer reduzierten Lungenpermeabilität 48 h nach der Infektion. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass das Ang/Tie2-System eine zentrale Bedeutung in der Pneumokokkenpneumonie hinsichtlich Inflammation und pulmonaler Hyperpermeabilität hat. Ein zuvor diskutierter Einsatz von Ang-2 als alleiniger prognostischer Biomarker für die schwere Pneumonie ist nach dieser Arbeit eher abzulehnen. Die Ergebnisse der experimentellen Untersuchungen geben jedoch Hinweise darauf, dass eine Veränderung des Ang-1/Ang-2-Verhältnisses einen möglichen therapeutischen Ansatz in der schweren Pneumonie darstellen könnte.

Despite effective antibiotic therapies, pathogen-host interaction in pneumonia may lead to excessive inflammation and endothelial hyperpermeability, which can result in lifethreatening lung failure and death. The treatment of acute lung injury is hitherto mainly supportive. To develop new therapeutic approaches and to identify pneumonia patients at high risk of mortality as early as possible, it is essential to elucidate pathomechanisms underlying pneumonia. Ang-1 and -2 are ligands of the receptor tyrosine kinase Tie2. Their roles in angiogenesis and tumor vascularization are well known, but they are also centrally involved in the development of endothelial permeability and inflammation. Generally Ang-1 evokes Tie2 activation, which in turn leads to an inactive, quiescent vascular endothelium, whereas on the contrary Ang-2 as the competitive antagonist leads to endothelial activation, increasing endothelial permeability and initiation of other inflammatory cascades. It has been shown that Ang-2 blood levels and the Ang-2/Ang-1 ratio were increased in sepsis and particularly in sepsis with lung failure. However, the role of the Ang/Tie2 system in severe pneumonia has not been investigated so far. The aim of this study was to analyze the role of the Ang/Tie2 system in pneumococcal pneumonia and to evaluate Ang-2 as a possible biomarker for risk stratification in severe pneumonia. Therefore, different experimental approaches were employed to assess the role and the therapeutic potential of the Ang/Tie2 system in pneumonia-induced acute lung injury. In a pilot analysis decreased Ang-1 and increased Ang-2 serum levels were observed in pneumonia patients (n = 20) as compared with healthy blood donors. In the following study, these results were verified. Furthermore, a difference in Ang-2 serum levels between survivors (n = 36) and non-survivors (n = 64) with significantly higher Ang-2 serum levels in non-survivors (28-day mortality) was determined. However, this finding could not be reproduced in a larger cohort study (n = 75 per group). Next, serum of mechanically ventilated intensive care unit patients during the course of pneumonia-induced ARDS (VALID study, n = 38) was analyzed. There were increased Ang-1 serum levels at study entry and 24 hours later. During recovery, Ang-1 increased and Ang-2 decreased almost to serum levels of healthy control subjects within seven days. To further decipher the kinetics of Ang-2 liberation in acute inflammation, a prospective, observational study was conducted with subjects who participated in the Berlin marathon (n = 18), which is known to be a pro- inflammatory event (RUNINFLAME). All subjects showed increased CRP levels 24 h after the run as compared with their pre-run levels, but not directly after the run. Notably, Ang-2 levels were highly increased directly after the run and returned to pre-run levels 24 h later, suggesting that Ang-2 is a very rapid marker of inflammation. For localization of Ang-1, Ang-2 and their receptor Tie2 in the lung, immunohistochemistry was performed on human lung tissue of pneumonia patients and healthy controls. Ang-1 was found to be expressed in various cell types, whereas Ang-2 and the receptor Tie2 were exclusively expressed in endothelial cells. In further in vitro studies, we observed that stimulation of endothelial cells (HUVECs) with pneumolysin (PLY), an important pathogenic factor of S. pneumonia, was associated with significantly increased Ang-2 release, while no effect on IL-6 release was documented. In Electrical cell substrate impedance sensing (ECIS) experiments Ang-2 had permeabilizing effects on HUVEC monolayers. Hypothesizing that Ang-2 might be involved in PLY-induced permeability, mice were intravenously treated with specific siRNA against Ang-2 (Atuplex), and their isolated perfused and ventilated lungs (IPML) stimulated with pneumolysin (PLY), an important pathogenic factor of S. pneumoniae. Lungs of mice treated with Ang-2 specific siRNA showed reduced permeability upon PLY stimulation compared to lungs of mice treated with luciferase-specific siRNA as control, suggesting that Ang-2 contributes to PLY-induced permeability in intact lungs. Finally, the role of the Ang/Tie2 system was examined in a mouse model of pneumococcal pneumonia. Pulmonary mRNA expression of Ang-2 increased in the course of pneumonia, while Ang-1 and Tie2 mRNA expressions were reduced. Remarkably, Ang-1 treatment of S. pneumoniae starting 22 h after infection led to reduced cytokine secretion, neutrophil recruitment and lung permeability 48 h after infection. In summary, the results suggest that the Ang/Tie2 system plays a central role in pneumoniaevoked inflammation and hyperpermeability. As discussed, Ang-2 does not seem to be suitable for risk stratification in severe pneumonia. However, the results from the different experimental approaches suggest that targeting the Ang-1/Ang-2 balance may provide a new therapeutic perspective in severe pneumonia.