dc.contributor.author
Resler, Tom
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:53:40Z
dc.date.available
2017-06-23T09:49:20.906Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1753
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5955
dc.description.abstract
As presented in my thesis, we made enormous progress in resolving the
molecular details of the photoreaction of the light-gated ion channel
channelrhodopsin-2 (ChR2), by applying time-resolved molecular spectroscopy. I
have shown that D253 is the primary proton acceptor and D156 the internal
proton donor of the retinal Schiff base of ChR2. The reprotonation of the
latter residue constitutes the molecular determinant for channel closure. Upon
H/D exchange of the solvent, the kinetic and vibrational isotope effects of
these reactions and that of E90, a key residue in ion selectivity, were
determined. My experiments with a pH indicating dye show that the de- and
reprotonation of E90 takes place during the life time of the desensitized P4
state. Thus, other conclusions that E90 plays a key role in channel opening
are clearly ruled out. Light-adapted ChR2 contains a mixture of all-trans and
13-cis retinal. I contributed to time-resolved analysis of the E123T variant
and we could show that the 13-cis photocycle does not lead to channel opening.
Furthermore, the channel opening tallies with transient changes in the amide I
vibration, identified as water influx to hydrate the peptide backbone. These
findings from ChR2 were confirmed by ex- pediments on variants of ChR2 that
exhibit accelerated (E123T) or delayed (D156E) channel opening. The associated
activation volumes are monitored and quantified by flash photolysis under
hydrostatic pressures. Finally, the loss-of-function variant R120H was
investigated, which exhibits wild-type photocycle kinetics but channel
activity is blocked. Time-resolved IR spectroscopy covering almost 13 decades
in time are presented (from 500 fs to s). An assignment of the arginine band
was not feasible, but the possible role of His-Arg interactions were discussed
and I demonstrated that R120 is not part of the proton release complex.
Although the mechanistic link between proton transfer reactions and channel
func- tion remain elusive, I could show that protonation dynamics are crucial
in the ChR2 photocylce and are related to ion conductance. ChR2 is the mayor
tool in optoge- netics and a detailed understanding of this ion channel is
supportive for medical application. Furthermore, it is a good model system for
other ion channels, because in ChR2 ion permeation is triggered repeatable,
non-invasive and reproducible by light, which allows the observation of
channel on- and off-gating with high temporal and spacial resolution.
de
dc.description.abstract
In meiner Dissertation präsentiere ich unsere Fortschritte bei der molekularen
Erforschung des lichtgesteuerten Innenkanals Kanalrhodopsin-2 (ChR2) mittels
zeitaufgelöster Spektroskopie. Ich konnte zeigen, dass D253 der primäre
Protonenakzeptor und D156 der primäre Protonendonor der Schiffschen Base in
ChR2 ist. Die Reprotonierung von D156 geht einher mit der Kanalschließung.
Durch Messungen in H2O und D2O konnten der kinetische und spektrale
Isotopeneffekt dieser Reaktionen und von E90 bestimmt werden. E90 is wichtig
für die Ionenselektivität, aber eine De- und Resprotonierungsdynamik wurde nur
im späten P4 Intermediat beobachtet. Damit konnten andere Schlussfolgerungen,
dass E90 eine wichtige Rolle bei der Kanalöffnung hat, widerlegt werden. Im
lichtadaptierten Zustand von ChR2 liegt das Retinal in der all-trans und
13-cis Konfiguration vor. Wir konnten anhand der E123T Variante zeigen, dass
der 13-cis Photozyklus nicht zu einer Kanalöffnung führen kann. Die Öffnung
des Ionenkanals folgt Schwingungsänderungen in der Amid I region, welche als
Einströmen von Wassermolekülen identifiziert wurde, welche die Helices
hydratisieren. Diese Korre- lation wurde mit Hilfe von Varianten bestätigt,
welche eine beschleunigte (E123T) bzw. langsamere (D156E) Kanalaktivität
zeigen. Die erwarteten Aktivierungsvol- umen wurden durch
Blitzlichtspektroskopie bei verschiedenen Drücken ermittelt. Die Variante
R120H hat keine Kanalaktivität mehr, jedoch einen unveränderten Photozyklus.
Zeitaufgelöste Absorptionsänderungen über fast 13 Dekaden (von 500 fs bis s)
wurden dargestellt. Die Zuordnung der Argininbande war nicht eindeutig, jedoch
wurden His-Arg Interaktionen im Detail erörtert und ich konnte zeigen, dass
R120H nicht Teil der Protonenabgabegruppe ist. Obwohl die genaue Verbindung
zwischen Protonierungsänderungen und Kanal- funktion nicht vollständig geklärt
wird, konnten wir zeigen, dass Protonierungs- dynamiken eine entscheidende
Rolle in ChR2 haben. Es ist das am häufigsten verwendete optogenetische
Werkzeug und detaillierte Erkenntnisse über dieses Pro- tein werden die
medizinische Anwendungsmöglichkeiten verbessern. Außerdem ist ChR2 ein gutes
Modellsystem für andere Ionenkanäle, da die Kanalöffnung nicht invasiv und
reproduzierbar durch Licht aktiviert werden kann. Dies ermöglicht die
Untersuchung der Kanalaktivität mit hoher zeitlicher und spektraler Auflösung.
de
dc.format.extent
xv, 102 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
channelrhodopsin-2
dc.subject
protonation dynamics
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::530 Physik::535 Licht, Infrarot- und Ultraviolettphänomene
dc.title
Time-Resolved Analysis of Protonation Dynamics in Channelrhodopsin-2
dc.contributor.contact
tom.resler@me.com
dc.contributor.firstReferee
Prof. Joachim Heberle
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Ulrike Alexiev
dc.date.accepted
2017-04-20
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000104959-4
dc.title.translated
Zeitaufgelöste Analyse der Protonierungsdynamiken in Kanalrhodopsin-2
de
refubium.affiliation
Physik
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000104959
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000021707
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access