Injury-induced DNA methylome plasticity in the peripheral nervous system of the rat

Abstract

Introduction: Recently, the dynamic characteristics of the adult methylome have been demonstrated in the central nervous system. Whether external stimuli can provoke DNA methylation changes in the peripheral nervous system has not been studied. The present work was based on the hypothesis that L5 spinal nerve injury induces DNA methylation changes in the L5 rat dorsal root ganglion (DRG). A rodent model of neuropathic pain, the Spinal Nerve Ligation (SNL) was employed to test this hypothesis. Methods: Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) was used to analyze DNA methylation of eight rat DRGs (four controls, four SNL). This method makes it possible to profile DNA methylation on a genome-wide scale, at single-nucleotide resolution. First, DNA is digested with a methylation-insensitive restriction enzyme, yielding fragments that contain at least two cytosine-phosphate-guanine-dinucleotides (CpGs). Subsequently the fragments are bisulfite-treated, leading to the desamination of the unmethylated cytosines into uracils, without affecting the other bases. Finally the fragments are amplified, sequenced and aligned to the reference genome. Results: Using an early time point of 24h post ligation this work reports widespread, highly significant (p≤10-4) cytosine hyper- and hypomethylation in about 1% of the 1.4 million CpGs captured by RRBS. These CpGs were termed dynamically differentially methylated CpGs (dDMCs). The epigenetic remodeling occurred mainly outside of CpG islands. 56% of the observed changes were located in promoter or genic regions and mainly affected genes belonging to the axon guidance pathway (p<10-11). Consistent with emerging models relying on genome-wide methylation and RNA-sequencing analysis, variation of methylation was not tightly linked with variation of gene expression. 44% of the dynamically changed CpGs were detected outside of genes. These intergenic dDMCs occurred in clusters, with neighboring dDMCs varying in the same direction. The positions of these dDMCs were compared to intergenic, tissue-specific differentially methylated CpGs (tDMCs) of liver, spleen, L4 control DRG and muscle. Dynamic changes affected those intergenic CpGs that were different between tissues (p<10-15) and almost never the invariant portion of the methylome (those CpGs that were identical across all tissues). This result suggests a dichotomy of the intergenic methylome in an invariant part—which remains stable across different tissues and conditions—and a plastic part that is more susceptible to alterations and encompasses CpG sites capable of responding to environmental changes such as nerve injury (dDMCs). After joining juxtaposed hyper- or hypomethylated dDMCs into respective regions, a motif enrichment analysis was performed. The top enriched DNA motifs matched with binding motifs of transcription factors with important roles in PNS development, regeneration, and sensory dysfunction, supporting the possibility that DNA methylation contributes to gene regulation by altering the conformation of transcription factor binding sites. Conclusion: This study demonstrates extensive methylome plasticity in the adult PNS providing a genome-wide account of epigenetics in pain. Future studies may address which of the cell types found in the DRG, such as specific groups of neurons or non-neuronal cells are affected by which aspect of the observed methylome remodeling.

Einleitung: Die dynamischen Eigenschaften des adulten Methyloms wurden kürzlich im zentralen Nervensystem beschrieben. Ob äußere Reize auch die DNA- Methylierungsmuster des peripheren Nervensystems beeinflussen können, wurde bisher nicht untersucht. Die Hypothese der vorliegenden Arbeit war, dass eine periphere Nervenschädigung Methylierungsveränderungen der DNA im Spinalganglion L5 hervorrufen kann. Dies wurde anhand eines neuropathischen Schmerzmodells nach Spinalnervenligatur (SNL) bei Ratten untersucht. Methodik: Mittels „Reduced representation bisulfite sequencing“ (RRBS) wurden die Methylome von acht Spinalganglien (vier Kontrollen, vier SNL) 24h nach SNL analysiert. RRBS ermöglicht die genomweite Untersuchung von DNA Methylierungen mit einer Auflösungsgenauigkeit einzelner Basenpaare. Dabei wird die DNA zuerst mittels eines Restriktionsenzyms in Fragmente geschnitten, die mindestens 2 Cytosin-phosphat-Guanin-Dinukleotide (CpGs) enthalten. Die nachfolgende Behandlung mit Bisulfit führt zur Desaminierung der unmethylierten Cytosinbasen in Uracilbasen, ohne die anderen Basen zu beeinflussen. Abschließend werden die DNA Fragmente amplifiziert, sequenziert und an das Referenzgenom angeglichen. Ergebnisse: Es zeigten sich weitverbreitete, hoch signifikante (p≤10-4) Cytosin Hyper- und Hypomethylierungen in etwa 1% der durch RRBS erfassten 1.4 Millionen CpGs. Diese wurden unter dem Begriff „Dynamisch differenziell methylierte CpGs“ (dDMCs) zusammengefasst. Die epigenetische Umgestaltung erfolgte größtenteils außerhalb der sogenannten CpG Inseln. 56% der beobachteten Veränderungen befanden sich in Promoter- oder Genregionen, insbesondere in Genen der „axonalen Wegfindung“ (p<10-11). Die vorliegende Arbeit fand keine Korrelation zwischen den Methylierungs-veränderungen und der Variation der Gen Expression und reiht sich damit in die wachsende Zahl von Studien mit genomweiten Analysen ein, die für eine komplexere Interaktion zwischen Methylom und Transkriptom sprechen. Die anderen 44% der dynamisch veränderten CpG Methylierungsmuster befanden sich außerhalb von Genen. Diese intergenischen dDMCs traten in Clustern auf, wobei sich benachbarte dDMCs immer in die gleiche Richtung veränderten. Ihre Positionen wurden mit intergenischen Gewebe-spezifischen differenziell methylierten CpGs (tDMCs) von Leber, Milz, Spinalganglion L4 und Skelettmuskel, verglichen. Bemerkenswert war, dass sich die Positionen der dDMCs mit denjenigen der tDMCs deckten (p<10-15) und fast nie den invarianten Teil des Methyloms betrafen (diejenigen CpGs, die in allen Geweben identisch sind). Das intergenische Methylom lässt sich damit in zwei Teile gliedern: ein invarianter Teil – welcher zwischen unterschiedlichen Geweben und unter verschiedenen Bedingungen unverändert stabil bleibt – und ein plastischer Teil, der auf Umwelteinflüsse wie z.B. die Verletzung des Spinalnervs reagieren kann. Weiterhin wurden die benachbarten hyper- oder hypomethylierten intergenischen dDMCs zu Regionen zusammengefügt und mittels Sequenzanalyse untersucht. Die häufigsten DNA Motive entsprachen Bindungsmotiven für Transkriptionsfaktoren mit wichtigen Rollen in der Entwicklung und Regeneration des peripheren Nervensystems und in sensorischen Funktionsstörungen. Methylomveränderungen könnten daher regulatorische Fernwirkungen auf Gene ausüben und so zur Entstehung, Aufrechterhaltung oder Regeneration neuropathischer Schmerzen beitragen. Schlussfolgerung: Die vorliegende Arbeit weist die ausgedehnte Plastizität des Methyloms im adulten peripheren Nervensystem nach. In weiterführenden Studien muss untersucht werden, welche einzelnen Zelltypen des Spinalganglions von charakteristischen Veränderungen betroffen sind.