Using GroEL (hsp60) for a Specific Quantification of Lactobacilli by Quantitative Real-Time PCR

Abstract

Probiotics are believed to promote beneficial influences on the functions of the gastrointestinal tract and thereby on health. Therefore, they are often used in dairy and non-dairy products for human nutrition, including running the fermentation process. Moreover, the feeding of animals with probiotics has also increased, particularly since the European Union approved a prohibition to use antibiotics for growth promotion. Since then, classic diagnostic methods have been used for the identification of species of the genera Lactobacillus and Bifidobacterium including phenotypic comparison with reference strains, physiological testings by API 50 CHL stripes (BioMérieux) and polymerase chain reaction (PCR). Different selective media and growth conditions are used to isolate probiotic species from food, resulting in time- consuming, labor-intensive diagnostic approaches. Furthermore, phenotypic characterization and species differentiation are error-prone. Nonetheless, the quantification approach of the used species is still missing, although besides safety, efficacy and viability, its amount also plays a significant role in exerting beneficial effects. Even FAO/WHO guidelines (2001) mention that probiotic bacteria are “live microorganisms that, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host”. However, this had not led to establishing a molecular-based rapid working tool to conduct diagnostics of probiotic bacteria in a working day. Given that probiotic action depends on the quality and quantity of the probiotic strains, a conventional PCR detection method is not feasible, as it does not allow any possibility to quantify the species of interest. As it turns out, several other techniques did not work to either detect or quantify. Thus, a real-time PCR method has been established within this thesis, complying with the requirements to identify and quantify probiotic species in food without a prior cultivation step. Indeed, a scientific method like this has been long overdue. The screening of different target-sequences for a species-specific identification of probiotic strains ruled out classic targets such as 23s-5s rRNA, due to a lacking species-specificity by multiple amplifications of different species. Thus, other targets such as the heat shock proteins (GroEL) were chosen for the specific identification of different species of the genus Lactobacillus. The ATPase subunit of the ATP- dependent clpC gene was selected for the species-specific identification of members of the genus Bifidobacterium. The validation of the real-time PCR primers has been successfully achieved using DNA isolates from several products. Herein, DNA isolated from yoghurt, tablet or granulate origin with probiotic bacteria has been used for specificity and quantification tests. In addition, species- specific TaqMan® real-time PCR primers have been successfully established for four different species of the genus Lactobacillus (L. acidophilus, L. brevis, L. helveticus, L. reuteri). Unfortunately, it was not possible to combine these four species-specific primers and the universal primer pairs within one multiplex TaqMan® real-time PCR. Moreover, even a combination of two TaqMan®-labeled primers failed. However, it was possible to demonstrate an accurate and reliable detection and quantification of L. reuteri in Reuflor® tablets, respectively. The main advantage of a real-time PCR method based on the same annealing conditions of different primer pairs is a rapid and species-specific detection, as well as the identification and quantification of different probiotic species within one single real-time PCR run within seven hours. Thus, this enables a fast and reliable diagnostic of probiotic species used in food and feed samples.

Man vermutet, dass probiotische Bakterien einen nützlichen Einfluss auf die Vorgänge im Darmtrakt haben und somit auch gesundheitsförderlich sind. Aufgrund ihrer Eigenschaft, den Fermentationsprozess in beispielsweise Milchprodukten einzuleiten, werden sie häufig in Produkten des täglichen und nichttäglichen Gebrauchs eingesetzt. Außerdem hat der Einsatz von Probiotika in der Tierernährung zugenommen, besonders seit die Europäische Union einen wachstumsfördernden, flächendeckenden Einsatz von Antibiotika verboten hat. Seitdem werden Spezies der Genera Lactobacillus und Bifidobacterium mit Hilfe klassischer Methoden identifiziert; hierzu gehören der phänotypische Vergleich mit Referenzstämmen, physiologische Testungen mit API 50 CHL Streifen (BioMérieux) und die Identifizierung mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR). Verschiedene Selektionsmedien werden zur Isolation probiotischer Spezien aus Lebensmitteln verwendet, die jedoch zeit- und arbeitsintensive Diagnostikmethoden erfordern. Die phänotypische Charakterisierung und die Spezies-Differenzierung sind sehr fehlerbehaftet. Hinzu kommt, dass es noch immer keine Quantifizierungsmöglichkeit gibt. Von Bedeutung sind neben der Unbedenklichkeit der eingesetzten Bakterienstämme auch die Effektivität und die Lebensfähigkeit der eingesetzten Bakterien. In den FAO/WHO-Richtlinien von 2001 steht, dass probiotische Bakterien “lebende Mikroorganismen sind, die, wenn sie in ausreichender Menge eingesetzt werden, eine gesundheitsfördernde Eigenschaft auf den Konsumenten haben”. Selbst diese Richtlinien haben nicht zur Etablierung einer schnellen, wissenschaftlichen und molekularbiologischen Methode geführt, um die Diagnostik probiotischer Bakterien innerhalb eines Arbeitstages durchführen zu können. Da die Wirkungsweise auf der Qualität und Quantität des vorhandenen probiotischen Bakterienstammes beruht, kann die konventionelle PCR Detektionsmethode nicht angewandt werden, da diese keinerlei Möglichkeit bietet, die zu detektierende Spezies auch zu quantifizieren. In dieser Arbeit wird eine real-time PCR Methode etabliert, um den Anforderungen der Identifizierung und der Quantifizierung gerecht zu werden. Eine solche Methode war längst überfällig. Es wurden verschiedene Target-Sequenzen zur spezies-spezifischen Identifizierung probiotischer Bakterien getestet und klassische Sequenzen wie die 23s-5s rRNA aufgrund fehlender Spezies-Spezifität durch Mehrfachamplifikationen verschiedener Spezies verworfen. Andere Targetgene wie beispielsweise das Hitzeschockprotein (GroEL) wurden zur Identifizierung verschiedener Spezies des Genus Lactobacillus ausgewählt. Die ATPase Untereinheit des ATP-abhängigen clpC-Gens wurde genutzt, um Spezies des Genus Bifidobacterium spezies-spezifisch nachweisen zu können. Zur Validierung dieser real-time PCR Primer wurden DNA- Isolate aus verschiedenen Produkten verwendet, wie beispielsweise DNA-Isolate aus Joghurt, Tabletten und Granulat. Sie wurden für die Spezifitäts- und Quantifizierungstests eingesetzt. In einem weiteren Ansatz wurden spezies- spezifische TaqMan® real-time PCR Primer für vier verschiedene Spezies des Genus Lactobacillus (L. acidophilus, L. brevis, L. helveticus, L. reuteri) erfolgreich etabliert. Es war nicht möglich, diese vier verschiedenen spezies- spezifischen Primer sowie die Universalprimerpaare erfolgreich in einer multiplex TaqMan® real-time PCR zu kombinieren. Sogar die Kombination von nur zwei TaqMan®-gelabelten Primern misslang. Es konnte aber gezeigt werden, dass eine akkurate und verlässliche Detektion und Quantifizierung von L. reuteri in Reuflor® Tabletten möglich war. Der eigentliche Vorteil der real-time PCR basiert auf der schnellen spezies-spezifischen Detektion, Identifikation und Quantifizierung verschiedener probiotischer Spezies während eines einzigen real-time PCR-Laufs innerhalb von sieben Stunden. Das ermöglicht eine schnelle und eindeutige Diagnostik probiotischer Spezies in Lebens- und Futtermittelproben.