Study of protein-cofactor interaction and electron transfer properties in modified photosystem I complexes by multifrequency time resolved electron paramagnetic resonance

Abstract

The goal of this thesis is the characterization of specific protein-cofactor interactions which control transmembrane electron transfer processes in Photosystem I of the cyanobacterial photosynthesis apparatus. Multifrequency Time Resolved Electron Paramagnetic Resonance (TR EPR) spectroscopy is applied to detect the sequential P700●+A1●- and P700●+FX- radical pair states created by light induced charge separation. Systematic variation of functionally relevant properties of protein-cofactor interactions is carried out in two ways: A) substitution of the native phylloquinone in the A1-binding site of Photosystem I complex by suitably modified synthetic or various other quinones. For the extraction/reconstitution procedure two methods were available for comparison: a “harsh” one, extraction of native phylloquinone by organic solvents, and a “soft” one, use of native quinone biosynthetic pathway deletion mutants with a more weakly bound rescue quinone (plastoquinone-9) in the A1-binding site; in each case reconstitution/replacement followed by offering the wanted quinone in excess. B) Selective variation of the protein environment in the cofactor site by site-directed mutation. In Part A the first incorporation concerns 2-methyl-1,4-naphthoquinones selectively labelled with a 13C isotope at one of the carbon positions (Chapter 5). A highly asymmetric spin density distribution is observed for the functional P700●+A1●- RP state. It provides solid evidence for a highly asymmetric (single-sided) hydrogen bond scheme between the protein environment and the quinone as it was suggested in the X-ray structure model for the ground state. The results on PS I complexes isolated from the menB rubA double mutant show: i) In spite of the absence of the [4Fe-4S] clusters FX, FA, FB and all stromal subunits PsaC, PsaD, PsaE the TR EPR detectable structural and essential protein-cofactor interaction features remain the same as observed for phylloquinone in the wild type. ii) Because plastoquinone-9 is more weakly bound into the A1-binding site of PS I it can be exchanged easily by a number of quinones (Chapter 6). In particular, 9,10-anthraquinone with a more negative redox potential than native phylloquinone was chosen for incorporation into the A1-binding site of Photosystem I both, in the presence and absence of the [4Fe-4S] clusters. Corresponding to the altered energetics the kinetics of consecutive electron transfer processes from A0 to AQ to FX are changed in a complementary way (Chapter 7). The first ET kinetics from A0 to AQ slows down, the second one from AQ to FX speeds up. Moreover, for the first time, the effect of the formal negative charge [Fe4S4(SCH3)4]2- associated with FX on an electron transfer step from A0 to A1 could be demonstrated. In part B first the influence of the specific aspartate residues on electron transfer from A1 to FX was studied by site-directed mutants in either the environment of the phylloquinone or the first iron-sulphur FX cofactor (Chapter 8). Changing from a negatively charged side chain to a neutral and to a positively charged one results in very small but systematic changes of the electron transfer kinetics from A1 to FX, consistent with the expected redox potential shifts depending whether the aspartate mutation concerns more the vicinity of A1 or FX. Furthermore, the axial methionine ligand to the central Mg atoms of the first acceptor A0 was chosen for mutation, either to asparagine (N) or leucine (L), selectively in the PsaA- or PsaB-branch (Chapter 9). In comparison to the wild type both PsaA-branch mutants show a decrease in the electron transfer rate from A0 to A1. These results agree well with those from complementary optical studies. They confirm asymmetric electron transfer, predominantly along the PsaA-branch. Extended conclusions are presented in the final Chapter 10.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung von Protein-Kofaktor- Wechselwirkungen in Photosystem I der Photosynthese, besonders soweit dadurch wichtige Funktionsmerkmale der lichtinduzierten Ladungstrennung durch transmembranen Elektronentransfer bestimmt werden. Hierzu wurde zeitauflösende Multifrequenz-Elektronspinresonanz Spektroskopie eingesetzt, womit funktionelle paramagnetische Zwischenzustände als Radikalionen-Paare (P700●+A1●- und P700●+FX-) in Echtzeit verfolgt werden können, wie sie im Verlauf der lichtinduzierten Elektrontransfer-Prozesse entstehen. Zwei Ansätze wurden verfolgt, um systematische Modifizierung von Protein-Kofaktor Wechselwirkungen vorzunehmen und Einzelbeiträge der funktionsbestimmenden Eigenschaften zu identifizieren: A) Ersetzen des nativen Chinon-Kofaktors in der A1-Bindungstasche durch geeignet modifizierte synthetische und auch andere Chinone. Zur Entfernung/Rekonstitution von Kofaktoren standen neben „harschen“ Extraktionsmethoden auch „sanfte“ Unterbrechungsmutanten im biosynthetischen Aufbauprozess der Kofaktoren zur Verfügung. B) Gezielte Veränderung der Proteinumgebung von Kofaktoren, insbesondere durch geeignete Punktmutation einzelner Aminosäuren in der Protein-Primärsequenz. Mit dem Einbau vom 13C- Isotopen markierten Chinon in der A1-Bindungstasche von Photosystem I (Kapitel 5) wurde die stark asymmetrische Spindichteverteilung für den funktionellen Radikalpaar-Zustand P700●+A1●- bestätigt, insbesondere da die C–O Gruppe (mit oder ohne Wasserstoff-Brücke) ausgedehnt werden konnten. Die im Röntgen- Strukturmodell für den Grundzustand geforderte stark asymmetrische Wasserstoff-Brückenbindung wurde so für den funktionellen ladungsseparierten Zustand nachgewiesen. Die Ergebnisse an Photosystem I Komplexen der menB rubA Doppelmutante zeigen: (i) Trotz der Abwesenheit der Eisen-Schwefel-Komplexe und der “stromalen” Protein-Untereinheiten (PsaC, PsaE und PsaD) bleiben alle ESR-zugänglichen strukturellen Eigenschaften, wie Lage, Orientierung des Chinons sowie wesentliche Protein-Kofaktor-Wechselwirkungen erhalten (Kapitel 6). (ii) Das eingebaute schwächer gebundene Ersatz-Chinon (Plastochinone-9) lässt sich einfach durch eine Reihe anderer Chinone ersetzen. Anthraquinone, wegen noch negativerem Redoxpotential als natives Phyllochinon besonders interessant ist, konnte in PS I mit und ohne [4Fe-4S]-Cluster eingebaut werden (Kapitel 7). Entsprechend der veränderten Energetik wird die Kinetik aufeinander folgender Elektronentransferprozesse komplementär modifiziert: der erste Prozess von A0 zu A1 ist verlangsamt, während der Nachfolgeprozess von A1 zu FX gegenüber Wildtyp beschleunigt abläuft. Erstmals konnte der Einfluss der partiellen negativen Ladung eines [4Fe-4S]-Clusters auf die Kinetik eines Elektronentransferprozesses nachgewiesen werden. Die Untersuchungen von Punkt- Mutanten in der Proteinumgebung von einem der beiden A1-Bindungstaschen bzw. vom ersten [4Fe-4S]-Cluster FX fokussierten auf den Einfluss von spezifischen Aminosäuren Aspartat mit negativ geladener Seitenkette (Kapitel 8) auf die Elektronentransfer-Kinetik. Die Veränderung der Seitenkettenladung von negativ zu neutral und zu positiv führt zu sehr kleinen, aber systematischen Änderungen der Elektronentransfer-Kinetik von A1 zu FX, konsistent mit den erwarteten Redoxpotenzial-Differenzen, je nachdem ob sich das mutierte Aspartat beim Chinon-A1-Bindungsplatz oder beim ersten [4Fe-4S]-Cluster befindet. Weiter wurde Methionin als Ligand zum A0-Kofaktor zur Mutation ausgewählt (Kapitel 9). Sowohl bei der Mutation zu Leuzin als auch zu Asparagin wird gegenüber dem Wildtyp verlangsamter Elektrontransfer von A0 zu A1 beobachtet. Die Ergebnisse stimmen sehr gut mit komplementären optischen Untersuchungen überein und belegen einen deutlich asymmetrischen Elektronentransfer entlang der PsaA-Seite der quasi-C2 symmetrischen räumlichen Anordnung der Elektronen-Akzeptoren.