In vitro Untersuchungen zur Wirkungsweise eines antifibrotisch wirksamen Antikörpers gegen Connective Tissue Growth Factor in Kombination mit Transforming Growth Factor-beta oder ionisierender Strahlung

Abstract

Der fibrotische Umbauprozess der Lunge kann unterschiedliche Ursachen haben. Eine davon ist die Bestrahlung des Thoraxraumes zur Therapie eines Mamma- oder Lungenkarzinoms. Vor dem Hintergrund der steigenden Inzidenz bösartiger Tumore in diesem Bereich gewinnt die Strahlentherapie eine immer größere Bedeutung. Häufig limitiert die Lunge als äußerst strahlensensibles Organ diese Behandlungsform, so dass eine kurative Tumorbestrahlung nicht möglich ist. Strahlung induziert über vielfältige, ineinander greifende Mechanismen die Entstehung einer Lungenfibrose. Trotz großer Fortschritte in der Erkenntnis der Pathogenese dieser Erkrankung und der Entwicklung neuer Therapiemethoden ist die Prognose der pulmonalen Fibrose infaust. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Zytokin-vermittelte Signalkaskade, die letztendlich in einer manifesten Fibrose endet, mittels eines gegen den Connective Tissue Growth Faktor (CTGF) gerichteten Antikörpers (FG-3019) experimentell gehemmt werden kann und welche Wirkungen FG-3019 auf Zellen hat, die an fibrotischen Umbauprozessen beteiligt sind. Um zelluläre Grundlagen für die in vivo beobachtete Wirkung von FG-3019 zu finden, wurde eine systematisch funktionelle in vitro Analyse durchgeführt, indem klonogene Assays, Proliferations-Assays, Adhäsions-Assays, Vitalitäts-Assays und Migrations- Assays durchgeführt wurden. Als funktioneller Aspekt wurde im Hinblick auf die Auswirkung von FG-3019 auf die „Epithelial-to-Mesenchymal-Transition“ (EMT) von an fibrotischen Prozessen beteiligten Zellen zusätzlich nach morphologischen Veränderungen gesucht und die Expression verschiedener Proteine untersucht. Als bedeutende und sich wechselseitig beeinflussende Faktoren im komplizierten Regelkreis der Fibroseentwicklung konnten CTGF und der Transforming Growth Faktorbeta (TGF-b) bestimmt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass TGF-b eine proliferationshemmende Wirkung auf Lungenfibroblasten ausübt, die Migration von Lungenfibroblasten steigert, aber auf die Adhäsion von Lungenfibroblasten keine Auswirkung hat. Stimulierend wirkt TGF-b auf die Synthese des Kollagens und des Proteins a-SMA, das die Kontraktion fibrotischer Areale fördert und somit ebenfalls eine Fibrose begünstigt. Während die Auswirkungen des TGF-b auf die Proliferation und die Migration der Lungenfibroblasten durch Zugabe des Antikörpers FG-3019 zum Teil rückgängig gemacht werden können, lässt sich die vermehrte Produktion von Kollagen und a-SMA nicht hemmen. Auch eine morphologische Veränderung der Zellen im Sinne einer EMT ist in den Untersuchungen nicht gefunden worden. Jedoch beeinflusst TGF-b die Lungenadenokarzinomzellen A549, indem er eine EMT induziert. Auch Kollagen und a-SMA werden unter TGF-b Einfluss von den A549-Zellen verstärkt exprimiert. An den Tumorzellen sind alle Wirkungen des TGF-b durch FG-3019 aufhebbar. So konnte in der vorliegenden Studie gezeigt werden, dass FG-3019 als Antikörper gegen den CTGF in der Lage ist, einige der profibrotischen Wirkungen des durch CTGF beeinflussten TGF-b teilweise aufzuheben. Auch allein gegeben zeigte FG-3019 eine inhibierende Wirkung auf das klonogene Wachstum, die Proliferation, die Vitalität und die Migration der Lungenfibroblasten. Da die durch TGF-b induzierte profibrotisch wirkende kollagene Exprimierung jedoch in den Lungenfibroblasten genau wie die Synthese von a-SMA durch FG-3019 nicht beeinflusst werden kann, sind hier eventuell weitere Studien nötig, um die genaue Wirkweise des FG-3019 zu erforschen. Da auch Tumorzellen des adenoiden Bronchialkarzinoms in der Lage sind TGF-b zu produzieren, kann die in den Ergebnissen dieser Arbeit festgestellte Hemmung des TGF-b Einflusses auf die Tumorzellen durch FG-3019 einen weiteren wichtigen Schritt in der Behandlung der Lungenfibrose darstellen, da die TGF-b Synthese durch Karzinome bislang mit einer erhöhten Fibrosegefahr und einer schlechten Prognose gekoppelt ist. Die Unterbrechung der Zytokin-vermittelten Signalkaskade, die letztendlich zu einer Fibrose führt, gilt als ein vielversprechender Ansatz in der Prävention und Therapie der Fibrose. Somit kann FG-3019, das auch schon in klinischen Tests mit Erfolg angewandt worden ist, einen Fortschritt auch in der Behandlung der strahlenbedingten Lungenfibrose darstellen. Weitere Studien können eventuell Aussagen treffen, inwieweit auch eine präventive Behandlung mit FG-3019 einen Fibroseschutz darstellen kann, so dass die Strahlentherapie effektiver zur Karzinombehandlung eingesetzt werden könnte.

The fibrotic remodelling process of the lung can have different causes. One is the radiation of the thorax for the treatment of breast or lung carcinomas. Because of the increasing incidence of malignant tumors in this region the treatment with radiation is of growing importance. Often the lung, as an extremely radiation sensitive organ, limits this form of treatment, so that a curative tumor radiotherapy is not possible. Radiation induces through diverse cross-mechanisms the development of pulmonary fibrosis. Despite great advances in the knowledge of the pathogenesis of pulmonary fibrosis and the development of new therapeutic methods, the prognosis of pulmonary fibrosis is still poor. In this study it was examined, whether the cytokine-mediated signalling cascade that ultimately ends in a manifest fibrosis, could be inhibited experimentally by an antibody (FG-3019) against the Connective Tissue Growth Factor (CTGF) and the effects FG-3019 has on cells involved in the fibrotic remodelling process of the lung. To find a cellular basis for the in vivo observed effect of FG-3019, a systematic functional in vitro analysis was carried out by clonogenic-assays, proliferation-assays, adhesion-assays, vitality-assays and migration-assays. In regard to the effect of FG-3019 on the "epithelial-to-mesenchymal transition" (EMT) of cells involved in fibrotic processes, it was looked for morphological changes and the expression of various proteins was examined as a functional aspect. CTGF and Transforming Growth Factor-beta (TGF-b) have been determined as important and mutually influencing factors in the development of fibrosis. The results of the present study show, that TGF-b exerts an antiproliferative effect on pulmonary fibroblasts and increases their migration, but has no effect on the adhesion of pulmonary fibroblasts. TGF-b has a stimulating effect on the synthesis of collagen and a-SMA, which promote the contraction of fibrotic areas and therefore also favour fibrosis. While the effects of TGF-b on the proliferation and migration of lung fibroblasts can partly be reversed by addition of the antibody FG-3019, the increased production of collagen and a-SMA cannot be restrained. Also, a morphological change of the cells in terms of EMT has not been found in the investigations. However, TGF-b does influence the lung adenocarcinoma A549 by inducing an EMT. Collagen and a-SMA are also increased expressed by A549 under TGF-b influence. In the tumor cells all the effects of TGF-b are cancelled by FG -3019. In the present study it was shown, that some of the profibrotic effects, which TGF-b has through CTGF, could partly be reversed by FG-3019. Given alone FG-3019 also shows an inhibitory effect on the clonogenic growth, proliferation, vitality and migration of pulmonary fibroblasts. Since the induced expression of collagen and a-SMA, both profibrotic active in the pulmonary fibroblasts through TGF-b, cannot be influenced by FG-3019, further studies are possibly necessary to investigate the exact mode of action of FG-3019. The inhibiting effect of FG-3019 on the impact of TGF-b on tumor cells that was found in this study can be another important step in the treatment of pulmonary fibrosis as tumor cells of the adenoid lung cancer are able to produce TGF-b themselves. Also, since the carcinoma induced TGF-b synthesis is associated with an increased risk of fibrosis and a poor prognosis up to now. The interruption of the cytokine- mediated signalling cascade that ultimately leads to fibrosis, is considered a promising approach in the prevention and treatment of fibrosis. Therefore FG-3019, which has been already used in clinical trials with success, can represent a progress in the treatment of radiation-induced pulmonary fibrosis. Further studies are necessary to clarify, whether a preventive treatment with FG-3019 has a protective fibrotic effect, so that radiotherapy could be used more effectively for the carcinoma treatment.