Studying the Interaction Profiles of Nonnatural Amino Acids – Towards Predicting their Specific Applications at α-Helical Interfaces

Abstract

Nonnatural amino acids are frequently incorporated into peptide-based pharmaceuticals to improve bioavailability and specificity. Systematic studies of how such residues interact with natural amino acids in the context of native protein folds may yield important information that can facilitate the prediction of the properties of novel nonnatural peptide therapeutics or biomaterials. To this end, the current study made use of phage display to screen large numbers of helical microenvironments to identify, based on binding affinity, natural peptide sequences that preferably interact with sequences containing either fluoroalkyl substituted amino acids or alternating sets of β- and γ-amino acids. The use of peptides that contain different analogues of (S)-2-aminobutyric acid with different numbers of fluorine atoms, and thus different side-chain volumes, showed that the incorporation of these amino acids into the hydrophobic core of a parallel heterodimeric coiled coil leads to similar pairing characteristics. Despite their differences in hydrophobicity and size, all investigated amino acids prefer to interact with the aliphatic amino acids leucine and isoleucine. However, the selection led to an optimized side chain packing which is expressed in thermal stability enhancements. It was verified that coiled coils readily accommodate diverse fluorinated aliphatic amino acids as nonnatural building blocks within their hydrophobic cores. In contrast, diverse α-amino acid patterns were found with recognition specificity for βγ-foldameric sequences, at the interface of parallel or antiparallel helical assemblies. Here, the sequences selected by phage display show that the incorporation of a polar H-bond donor functionality can significantly improve helical interactions involving backbone extended amino acids, because these donors are able to engage a free backbone carbonyl of αβγ-chimeras in an interstrand H-bond. A mutation leading to an increase of the surface area of the hydrophobic core had a similar effect on the thermal stability. Finally, initial studies were carried out towards the rational design of a protease resistant peptide-based inhibitor of HIV’s gp41 envelope protein subunit. Gp41 is thought to play a key role in infection by facilitating host cell entry via the assembly of a bundle of six α-helices composed of three N-terminal heptad repeat (NHR) segments and three C-terminal heptad repeat (CHR) segments. Several short C-peptide analogues of differing length were intrahelically crosslinked to increase α-helicity, and tested for binding affinity to NHR segments. A CHR derived peptide sequence was generated that shows affinity for a NHR segment, and may therefore inhibit bundle formation. The highly conserved Trp-Trp-Ile motif, which is crucial for tight helix alignment, constitutes the center of this CHR peptide and will serve as a starting point for systematic substitution studies with fluorinated aliphatic amino acid analogues.

Nichtnatürliche Aminosäuren werden häufig in peptidbasierte Pharmazeutika eingebaut, um deren Bioverfügbarkeit und Spezifität zu erhöhen. Die systematische Untersuchung der Interaktionsprofile solcher Aminosäuren mit ihren natürlichen Analoga in nativen Proteinumgebungen liefert wertvolle Erkenntnisse, die Vorhersagen über die Eigenschaften neuartiger nichtnatürlicher peptidbasierter Therapeutika und Biomaterialen ermöglichen. In dieser Arbeit sollten mithilfe von phage display Wechselwirkungspartner identifiziert werden, die bevorzugt mit fluoralkylsubstituierten Aminosäuren oder mit Motiven alternierender β- und γ-Aminosäuren, im Kontakt helikaler Strukturen interagieren. Die Untersuchung von Peptiden mit unterschiedlichen fluorierten Analoga von (S)-2-Aminobuttersäure zeigte, dass der Einbau solcher Aminosäuren in den hydrophoben Kern eines parallelen, heterodimeren coiled coil-Faltungsmotivs ähnliche Wechselwirkungspartner hervorbringt. Trotz deutlicher Unterschiede in Größe und Hydrophobie der fluorierten Seitenketten, bevorzugen alle hier untersuchten Aminobuttersäureanaloga die aliphatischen Aminosäuren Leucin oder Isoleucin als ihre natürlichen Wechselwirkungspartner. Die Selektion führte zu einer optimierten Packung um die fluorierten Seitenketten, was sich in einer thermischen Stabilitätserhöhung äußerte. Diese Studie verifiziert, dass coiled coil-Strukturen bereitwillig verschiedene fluoralkylsubstituierte Aminosäuren in ihrem hydro-phoben Kern als nichtnatürliche Bausteine akzeptieren. Im Gegensatz dazu wurden mittels phage display diverse heptad repeat-Muster selektiert, die Erkennungsspezifitäten für βγ-Foldamere an der Grenzfläche von parallelen und antiparallelen α-helikalen Anordnungen aufweisen. Mit den selektierten Sequenzen konnte gezeigt werden, dass durch die Einführung von ausgewählten, polaren Wasserstoff-brückendonoren die Stabilität von Interaktionen zwischen rückgraterweiternden β- und γ-Aminosäuren und α-peptidischen Motiven erhöht wird. Diese Donoren sind in der Lage Wasserstoffbrücken mit freien Rückgratcarbonylgruppen von αβγ-Chimären auszubilden. Zusätzlich können auch Mutationen, die die Oberfläche des hydrophoben Kerns vergrößern zu einer thermischen Stabilisierung beitragen. Schließlich wurden einleitende Studien zur rationalen Entwicklung von proteasestabilen, peptidbasierten Inhibitoren der gp41 Hüllproteinuntereinheit von HIV durchgeführt. Es wird angenommen, dass gp41 während der Infektion eine Schlüsselrolle einnimmt, indem es ein Bündel aus sechs Helices ausbildet, das sich aus drei N-terminalen Heptad- Repeat (NHR) Segmenten und drei C-terminalen Heptad-Repeat (CHR) Segmenten zusammensetzt. Mehrere C-Peptid Analoga unterschiedlicher Länge wurden intrahelikal verbrückt, um ihre α-Helizität zu erhöhen. Die Auswirkungen dieser Modifikation auf die Bindungsaffinität zu NHR Segmenten wurden untersucht. Außerdem wurde eine CHR Sequenz generiert, die bindungsaffin zu einem NHR Segment ist und somit möglicherweise die Ausbildung des hexameren Bündels inhibieren kann. Das hochkonservierte Trp-Trp-Ile Motiv, das für die Bündelausbildung ausschlaggebend ist, befindet sich in der Mitte dieser Sequenz und wird in künftigen Untersuchungen als Ausgangspunkt für Substitutionsstudien mit fluorierten Aminosäuren fungieren.