Struktur- und Funktionsuntersuchungen an Mesodermdevelopment (MESD), ein Chaperon für Rezeptoren der LDLR-Familie

Abstract

Die Familie der ``Low Density Lipoprotein Receptors''(LDLR) ist an einer Vielzahl physiologisch bedeutender Prozesse beteiligt. Der namensgebende LDL- Rezeptor ist eingehend für seine Bedeutung in der Cholesterolhomöostase charakterisiert. Er bindet und internalisiert mit Cholesterol angereicherte LDL-Partikel. Die meisten Rezeptoren der LDLR-Familie sind an der Endozytose verschiedenster Substanzen beteiligt. Die Kontrolle des zellulären Transports verschiedener Membranproteine sowie die Initiierung bestimmter Signalwege sind weitere Funktionen. So sind beispielsweise der SorLa- sowie die LRP-Rezeptoren an der Sortierung des Amyloidvorläuferproteins (APP) beteiligt. VLDL- und apoER2-Rezeptoren kontrollieren über die Bindung von Reelin die neuronale Migration. LRP5- und LRP6-Rezeptoren steuern als Korezeptoren des Wnt- Signalwegs die Embryonalentwicklung. Diese Funktionen setzen korrekt gefaltete und an der Zelloberfläche lokalisierte Rezeptoren voraus. Die Faltung der LDLR-Rezeptoren ist eine komplizierte Aufgabe. Einerseits aufgrund der hohen Zahl intramolekularer Disulfidbrücken innerhalb der ``complement-type repeat''(CR)-Domänen sowie der ``EGF-ähnlichen''-Domänen, andererseits infolge einer komplexen Faltung von sechs aufeinander folgenden YWTD-Motiven zu einer sechsblättrigen β-Propellerstruktur. In Säugetierzellen wird die Faltung dieses β-Propellers durch ``mesodermdevelopment'' (MESD), ein im Endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiertes Protein, vermittelt. Über die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von MESD ist wenig bekannt. Insbesondere liegen keine Informationen zum Mechanismus der durch MESD vermittelten Rezeptorfaltung vor. Mittels 1H-15N-HSQC-NMR-Spektroskopie von sechs unterschiedlich langen Konstrukten von MESD konnte ein sowohl strukturierter als auch hoch konservierter Kernbereich zwischen den Resten K43 und K184 identifiziert werden. Die Bestimmung der atomaren Struktur dieses konservierten Kernbereichs mittels NMR-Spektroskopie ergab eine eigenständige Domäne zwischen den Resten T104 bis E177. Diese Kerndomäne ist in der Natur weit verbreitet und besitzt dennoch eine außergewöhnlich geringe Sequenzhomologie. Aufgrund erhöhter Flexibilität der Reste D45-K103 war keine eindeutige Strukturbestimmung dieses Bereichs möglich. Daher wurde in Korrellation mit allen durchgeführten Experimenten eine globuläre Modellstruktur von MESD45-184 berechnet, welche N-terminal der Kerndomäne über eine längere flexible Region durch eine weitere α-Helix ergänzt wird. Die Vermittlung der korrekten Rezeptorfaltung durch MESD setzt eine Interaktion mit ungefaltetem Rezeptorprotein voraus. Bindungsstudien mit MESD an einer Bibliothek aus 16 Reste langen Rezeptorfragmenten führte zur Identifizierung der Interaktionsbereiche zwischen MESD und den ungefalteten LDLR-Rezeptoren. Die Art der Wechselwirkungen sind sowohl hydrophob als auch polar. Basierend auf der statistischen Auswertung der Peptidsequenzen mit Bindungsaktivität zu MESD konnte ein Erkennungsmotiv ermittelt werden. Demnach bindet MESD an einen Kern aus hydrophoben Resten, welcher durch einige basische Reste unterbrochen ist. Auf Basis der erhaltenen strukturellen und funktionellen Informationen erfolgt die Diskussion eines durch MESD vermittelten Faltungsmechanismus des β-Propellers.

The family of low density lipoprotein receptors covers a wide range of physiologically important cellular functions. The founding member, LDLR, has mainly been characterized for its function in systemic cholesterol homeostasis. It rapidly binds cholesterol-rich LDL particles and triggers their internalisation. Indeed, most family members are involved in endocytosis. A different function is the controlling of cellular trafficking of various membrane proteins. The sorLA-receptor and LRP-receptors are, for example, involved in the sorting of the amyloid precursor protein (APP). The binding of other factors does not serve functions in internalization but is initiating specific cellular signalling events, e.g. controlling neuronal migration (Reelin binding to apoER2 and VLDLR) or embryonic development (WNT proteins binding to LRP5 and LRP6). These functions depend on the presence of correctly folded receptors at the cell surface, where the proteins arrive after synthesis and post-translational maturation. The folding of LDLRs is a difficult task, partly because of a very high number of intramolecular disulfide bonds present in either the complement-type repeat (CR)-domains or in the epidermal growth factor (EGF)-domains, and probably also because of the very complex packing of six contiguous YWTD repeats into a six-bladed β-propeller structure. In mammalian cells, the folding of the β-propeller in the endoplasmic reticulum (ER) is assisted by mesoderm development (MESD). Little is known about the structural and functional properties of MESD. In particular, it is not known how this protein serves its function as a molecular chaperone. Using 1H-15N-HSQC-NMR-Spectroscopy of six different long MESD constructs a both well structured and highly conserved core region corresponding to residues K43-K184 could be identified. By structure determination based on NMR-Spectroscopy this MESD core region could be shown to fold into a single domain between residues T104-E177. This core-domain of MESD is shown to be frequent but of exceptionally low sequence homology. An increased flexibility of residues D45-K103 didn't allow an unambiguous Structure determination of this region. In correlation to all effected experiments a globular model structure of MESD45-184 was calculated instead, in which the core-domain is extended N-terminally over a long flexible part by an additional α-helix. For a MESD assisted folding of the LDLR-receptors an interaction of MESD to unfolded nascant receptorprotein has to be considered. By screening a peptide library containing 16 residue long receptor fragments with MESD, the interaction interface between MESD and the unfolded receptors could be identified. These interactions are both hydrophobic and polar induced. Based on the statistical analysis of MESD-binding sequences a recognition motiv for MESD could be identified. It consists of a hydrophobic core being interrupted by some basic residues. By means of these structural and functional results a mechanism for the MESD assisted folding of the β-propeller is discussed.