Mutationen und aberrantes alternatives Spleißen von Ten-Eleven Translocation 2 (TET2) in myeloproliferativen Neoplasien

Abstract

Ten-eleven translocation 2 (TET2) katalysiert die Oxidation von 5-Methylcytosin in Desoxyribonukleinsäure (DNA) und damit einen entscheidenden Schritt der epigenetischen Expressionskontrolle. TET2-Mutationen spielen eine Rolle bei der Pathogenese maligner hämatologischer Erkrankungen und sind, beispielsweise in der akuten myeloischen Leukämie (AML), von prognostischer Relevanz. Initiale Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer schnellen und kostengünstigen Methode zur TET2-Mutationsanalyse für die klinische Praxis. Aufgrund des zur Verfügung stehenden Einkapillarsequenzierers (Applied Biosystems ABI310) und da Mutationen über die gesamte Länge des Gens auf multiplen Exons gefunden werden können, bot sich die Kapillarsequenzierung, basierend auf der Amplifikation von 1400 bp langen cDNA Fragmenten aus Knochenmarksaspiraten, als Methode an. Neben 18 humanen Zelllinien wurden 34 Patientenproben mit myeloproliferativen Neoplasien (MPN) und nachgewiesener aktivierender Mutation der Janus Kinase 2 (JAK2V617F) und zum Vergleich 10 Patientenproben mit chronischer myeloischer Leukämie (CML) und Nachweis des Fusionsgens BCR/ABL untersucht. Alle trunkierenden Mutationen (also frameshift- und nonsense- Mutationen) wurden als pathologisch gewertet, ebenso wie alle missense-Mutationen im Bereich der zwischen allen Mitgliedern der TET-Genfamilie konservierten homeoboxes 1 und 2. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Detektion von TET2-Mutationen in myeloischen Neoplasien mittels Kapillarsequenzierung aus komplementärer DNA (cDNA) grundsätzlich möglich ist. Weder in den zwölf untersuchten AML- Zelllinien noch in den vier untersuchten CML-Zelllinien fanden sich pathologische TET2-Mutationen. Einzig in MOLM-20, einer Schwesterzelllinie von CNLBC1, welche aus dem peripheren Blut einer Patientin mit Chronischer Neutrophiler Leukämie (CNL) etabliert worden war, zeigten sich zwei pathologische TET2-Mutationen. Es bestand ein signifikanter (p=0.046) Unterschied in der Frequenz von pathologischen TET2-Mutationen zwischen den JAK2V617F-positiven Proben (11/34, 32%) und den BCR/ABL-positiven Proben (0/10). Dies deutet darauf hin, dass TET2-Mutationen bei der Pathogenese JAK2V617F-positiver MPN auf der einen und der CML auf der anderen Seite eine unterschiedliche Rolle spielen. Da in einem Knochenmarksaspirat neben dem malignen Klon auch somatische Zellen und damit somatische DNAs vorliegen und die Sensitivität der Kettenabbruchsequenzierung zur Mutationsdetektion abnimmt, je mehr somatische DNA in einer untersuchten Probe vorhanden ist, erfolgte die Auswahl von in der JAK2V617F-Schmelzkurvenanalyse hochpositiven Proben unter der Annahme, dass in diesen Proben der Anteil des JAK2-mutierten Klons relativ zum somatischen Hintergrund hoch ist. Zum Vergleich wurden auch Proben mit einem niedrigpositiven Ergebnis der JAK2V617F-Schmelzkurvenanalyse untersucht. Allerdings bestand kein Unterschied in der Frequenz von TET2-Mutationen zwischen den hochpositiven und niedrigpositiven Proben (7/24 vs. 4/10, p=0.692). Die Tatsache, dass TET2-Mutationen durch Kettenabbruchsequenzierung nachgewiesen werden können, auch ohne dass bereits ein dominanter JAK2V617F-Klon mit einem hochpositiven Schmelzkurven- analysenergebnis vorliegt, kann als Hinweis darauf gewertet werden, dass TET2-Mutationen im Laufe der klonalen Evolution vor JAK2-Mutationen auftreten. Die hier gewählte Methode der Sequenzierung von cDNA eröffnete die Möglichkeit der Beschreibung von neuen, teils noch unbekannten alternativen Spleißvarianten von TET2. Dies bestand im Einzelnen im Nachweis eines weiteren Exons, Exon 3b, durch cDNA-Sequenzierung und Segmentlängenanalyse von PCR- Produkten aus cDNA in MPN sowie der Beschreibung des Skippings von Exon 4. Beide Ereignisse traten in den JAK2V617F-positiven Patientenproben häufiger auf als in BCR/ABL-positiven Proben und beide haben eine Trunkierung und damit Inaktivierung des Tumor-Suppressor-Proteins TET2 zur Folge. Das alternative Spleißen von Boten-RNA (mRNA) stellt einen hochflexiblen Kontrollmechanismus für die Genexpression in Eukaryoten dar, der auch in der Pathogenese maligner Erkrankungen eine Rolle spielt. Im Lichte der Entdeckung häufiger Mutationen von Genen des Spliceosoms in hämatologischen Neoplasien im Jahr 2011 und damit assoziiertem aberrantem Spleißen von Genen wie TET2 legen diese Beobachtungen nahe, dass aberrantes alternatives Spleißen einen weiteren Mechanismus zur Inaktivierung von TET2 in myeloproliferativen Neoplasien darstellt und dass dieser in JAK2V617F-positiven MPN häufiger auftritt als in der CML, beziehungsweise der AML. Insbesondere das Auftreten trunkierender Exon 3B Insertionstranskripte war hochsignifikant mit myeloproliferativen Erkrankungen ausserhalb des CML/AML Formenkreises assoziiert.

There is now conclusive evidence that mutations of ten-eleven translocation 2 (TET2) play a key role in the development of hematological malignancies. As mutations can be found along the complete length of TET2, I sequenced TET2 cDNA from bone marrow aspirates following amplification of 1400bp fragments to develop a quick mutational analysis for routine clinical use. Pathological TET2 mutations were detected in 11/34 JAK2 V617F-positive and in 0/10 BCR-ABL- positive samples (p=0.046). Furthermore, I observed expression of an additional, novel exon containing an in-frame stop codon in 19/33 JAK2 V617F- positive samples but not in any of the 10 BCR-ABL-positive samples (0/10, p=0.001). I suspect that alternative splicing is an additional, frequent mechanism of TET2 inactivation in MPN that can easily be tested for by PCR from cDNA.