A-Kinase Anchoring Protein-based compartmentalization of kinases in the control of canonical Wnt signaling and Aquaporin-2 trafficking

Abstract

Protein kinase anchoring by scaffolding proteins is a cornerstone in the regulation of molecular pathways. One of the best studied examples is anchoring of Protein Kinase A (PKA) by A-Kinase Anchoring Proteins (AKAPs). The present study investigates the involvement of PKA-containing signalosomes in two distinct contexts. The first part of this thesis relates to the role of AKAPs in the regulation of canonical Wnt signaling. Canonical Wnt signaling plays a role in a plethora of molecular mechanisms, including cell proliferation and fate determination, with important clinical implications in several pathologies, including cancer. Wnt signaling inhibition in basal state cells relies on the proteolysis of β-catenin. This depends on Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK3β) phosphorylation of β-catenin, and is antagonized by PKA. The present study addresses the role of the cytosolic AKAP Glycogen Synthase Kinase Interaction Protein (GSKIP), and reveals how this scaffold scavenges both PKA and GSK3β away from β-catenin. The result is that GSKIP promotes and inhibits Wnt signaling, highlighting the importance of the GSKIP- mediated PKA-GSK3β crosstalk in the control of Wnt signaling. The second part of the thesis describes novel findings about the translocation of the water channel Aquaporin-2 (AQP2) into the plasma membrane of renal principal cells. AQP2 insertion increases water permeability of the collecting duct, fine- tuning water homeostasis. This process is not yet entirely understood. Deregulations of AQP2 translocation result in either excessive water excretion or retention, and are clinically relevant in both cases. Previous research established an automated immunofluorescence-based screening and identified the poorly characterized Cyclin Dependent Kinase 18 (CDK18) involvement in AQP2 regulation. In the second part of the thesis it is described how CDK18 is able to control AQP2 localization, abundance and phosphorylation. It was also discovered that the E3 ubiquitin ligase STIP1 Homology And U-Box Containing Protein 1 (STUB1) is interacting with CDK18 and mediates the CDK18-driven AQP2 ubiquitination. STUB1 is additionally responsible for the binding of PKA in proximity with CDK18 and AQP2, behaving in an AKAP-like way. The identification of a novel kinase involved in the control of AQP2 translocation could pave the way to a causal pharmacological window for AQP2-related pathologies.

Die räumliche und zeitliche Kontrolle von Proteinkinasen durch Gerüstproteine ist ein Meilenstein der Regulation molekularer Signalwege. Eines der bisher am besten untersuchten Beispiele ist die intrazelluläre Lokalisation von Protein Kinase A (PKA) durch A-Kinase Ankerproteine (AKAP). Diese Arbeit untersucht die Rolle von PKA- basierten Signalkomplexen in zwei unterschiedlichen Modellen. Der erste Teil der Dissertation befasst sich mit der Rolle von AKAPs in der Regulation des kanonischen Wnt-Signalweges, der eine Vielzahl von molekularen Mechanismen reguliert. Unter anderem ist er für Zellproliferation und –differenzierung entscheidend und spielt daher eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Tumorerkrankungen. Im Grundzustand der Zelle wird das Wnt- Signal durch Proteolyse des Effektorproteins β-catenin inhibiert. Der Abbau wird durch Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK3β)-Phosphorylierung von β-catenin induziert; umgekehrt führt eine Phosphorylierung durch PKA zur Stabilisierung des Proteins. In dieser Arbeit wurde das AKAP Glycogen Synthase Kinase Interaction Protein (GSKIP) untersucht, das sowohl PKA als auch GSK3β binden kann, und gezeigt, wie es den Zugang beider Kinasen zu β-catenin regulieren kann. Somit kann GSKIP den Wnt- Signalweg sowohl fördern als auch inhibieren, was die Bedeutung von GSKIP für das PKA-GSK3β-Zusammenspiel im Wnt-Signalwegs hervorhebt. Im zweiten Teil der Dissertation werden neue Mechanismen beschrieben, die eine Umverteilung des Wasserkanals Aquaporin-2 (AQP2) in die Plasmamembran von renalen Hauptzellen regulieren. Der Einbau von AQP2 in die Plasmamembran erhöht die Wasserpermeabilität des renalen Sammelrohrs und trägt zur Feinregulation des Wasserhaushalts bei. Dieser Prozess unterliegt einem komplexen Zusammenspiel von Enzymen und Gerüstproteinen, das im Ganzen noch nicht verstanden ist. Fehlregulationen der AQP2-Umverteilung führen zu einem exzessiven Wasserverlust über den Primärharn bzw. zu einer abnormalen Wasserretention. In einer vorangegangenen Studie wurde ein automatisiertes Immunfluoreszenzmikroskopie-basiertes Verfahren entwickelt, das die bisher wenig charakterisierte Kinase CDK18 (Cyclin Dependent Kinase 18) als entscheidend für die AQP2 Umverteilung identifizierte. In dieser Arbeit wird beschrieben, wie CDK18 die Lokalisierung, Proteinmenge und den Phosphorylierungsstatus von AQP2 kontrolliert. Die E3 Ubiquitin-Ligase STUB1 (STIP1 Homology And U-Box Containing Protein 1) interagiert mit CDK18 und vermittelt über CDK18 die Ubiquitinierung von AQP2. STUB1 hält PKA in räumlicher Nähe zu CDK18 und AQP2 und weist damit eine AKAP-ähnliche Funktion auf. Die Identifizierung einer neuen, für die AQP2- 7 Umverteilung relevanten Kinase könnte neuartige pharmakologische Ansätze für die kausale Behandlung von AQP2-basierten Krankheiten liefern.