Immunhistochemische und molekularbiologische Identifikation der SNARE-Proteine Syntaxin 3, SNAP 23 und Cellubrevin (VAMP 3) in gastrointestinalen sowie hepatopankreatischen Geweben und neuroendokrinen Tumoren

Abstract

Identifikation der SNARE-Proteine Syntaxin 3, SNAP 23 und Cellubrevin (VAMP 3) in gastrointestinalen sowie hepatopankreatischen Geweben und neuroendokrinen Tumoren SNAREs (souble NSF attachment protein receptor) agieren als Schlüsselproteine der Membranfusion. Als sog. vesikelassoziierte v-SNAREs und zielmembrangebundene t-SNAREs (target membrane) sind sie an grundlegenden Schritten intrazellulärer Transportvorgänge und der Exozytose beteiligt. Auch in gastrointestinalen und hepatopankreatischen Geweben sowie neuroendokrinen Zellen vermitteln sie die basalen Mechanismen der endo- und exokrinen Sekretion. Bislang existieren jedoch wenig morphologischen Daten über die zelluläre und subzelluläre Verteilung dieser Proteine in humanen Geweben. Somit war es Ziel der vorliegenden Arbeit, die Präsenz der drei nonneuronalen SNARE-Proteine Syntaxin 3, SNAP 23 und Cellubrevin im humanen Gastrointestinaltrakt in situ zu charakterisieren. Insbesondere war ihre Identifikation in enteroendokrinen Zellen und neuroendokrinen Tumoren von Interesse. In den experimentellen Untersuchungen wurden polyklonale Antikörper gegen humane Peptidsequenzen der SNAREs Syntaxin 3, SNAP 23 und Cellubrevin (VAMP 3) eingesetzt. Die SNARE-Charakterisierung wurde anhand immunhistochemischer Methoden wie APAAP und Immunfluoreszenz an über 50 humane Gewebe des gastroenteropankreatischen Systems und der Leber sowie 20 NET vorgenommen. Zudem wurde ihr Proteinnachweis im Western Blot in 16 gastrointestinalen Tumorzelllinien, Mastzelllinien sowie den neuroendokrinen Zelllinien BON, PC-12 und QGP-1 analysiert. Syntaxin 3, SNAP 23 und Cellubrevin waren in allen untersuchten Geweben in unterschiedlichem Expressionsmuster vorhanden. Sie scheinen in exo- und endokrine Sekretionsvorgänge involviert zu sein. Beispielsweise fanden sich Syntaxin und Cellubrevin in A-, B- und D-Zellen der Pankreasinsel. Alle drei SNAREs wurden im exokrinen Pankreasgewebe identifiziert und könnten hier in die Zymogengranulasekretion einbezogen sein. SNAP 23 wurde, als erstes SNARE- Protein überhaupt, in Kupfferschen Sternzellen, den Makrophagen der Leber vorgefunden. Als zentraler Aspekt dieser Arbeit gelang ebenso erstmalig die Charakterisierung nonneuronaler SNARE-Proteine in neuroendokrinen Zellen entlang der gesamten gastrointestinalen Mukosa und in diversen neuroendokrinen Tumoren. Ihr subzellulärer Nachweis in den SLMVs (synaptic like microvesicles) und LDCVs (large dense core vesicles) neuroendokriner BON-Zellen bestätigte ihre enge Beziehung zur Vesikelsekretion. Weiterhin konnte ihre Präsenz in mukosassoziierten Immunzellen wie Mastzellen, Plasmazellen und Leukozyten in situ erbracht werden. Darüber hinaus fand sich eine SNARE-Proteinexpression in allen betrachteten Zelllinien unterschiedlicher Differenzierung. Der SNARE- Mechanismus scheint somit während der neoplastischen Transformation erhalten zu bleiben. Die vorliegenden Arbeit veranschaulicht die Expression der SNARE- Proteine Syntaxin 3, SNAP 23 und Cellubrevin in humanen Geweben, neuroendokrinen Tumoren und diversen Zelllinien. Sie scheinen in essenzielle SNARE-vermittelte endokrine und exokrine Sekretionsvorgänge des humanen Gastrointestinaltrakts eingebunden zu sein. Insbesondere aber handelt es sich um die ersten nonneuronalen SNAREs, die in enger Assoziation mit den zwei Vesikeltypen neuroendokriner Zellen sowie in neuroendokrinen Tumoren nachgewiesen werden konnten.

Identification of the SNARE proteins Syntaxin 3, SNAP 23 and Cellubrevin (VAMP 3) in the gastrointestinal mucosa, hepatopancreatic tissues and neuroendocrine tumors. SNARE (souble NSF attachment protein)- receptor proteins are the core machinery for membrane fusion during intracellular vesicular transport and synaptic vesicle exocytosis in many tissues. As v-SNAREs (vesicle- associated) and t- SNAREs (target- membrane), they are known to play an important role in vesicle docking and fusion. In gastrointestinal and hepatopancreatic tissues they seem to mediate basic steps in exocrine and endocrine secretory function. In addition, neuroendocrine cells and tumors are characterized by SNARE- mediated regulated secretion of neurotransmitters and peptide hormones. It is essential to know the main SNARE-proteins involved in this processes. Therefore, we studied the in-situ-distribution of three nonneuronal SNARE proteins: the t-SNAREs syntaxin 3 and SNAP 23 and the v-SNARE cellubrevin. For this reason, the presence of syntaxin 3, SNAP 23 and cellubrevin was analyzed by tissue staining using polyclonal antibodies. The SNARE-characterization was performed by immunhistochemical methods like APAAP and immunoflourescence in human tissue samples of gastrointestinal mucosa, hepatopancreatic tissues and in a panel of about 20 neuroendocrine tumors. The special focus of the study was on their content and subcellular distribution in neuroendocine cells. In addition, their protein expression was analyzed by western blotting in different gastrointestinal cell lines, mast cells and and the neuroendocine cell lines BON, QGP-1 and PC-12. Syntaxin 3, SNAP 23 and cellubrevin are present in all investigated tissues in a specialized staining pattern. They may be involved in different steps of SNARE-mediated exocrine and endocrine membrane fusion. For example, syntaxin and cellubrevin were detected in A-, B- and D- cells of pancreatic islets. All of the three nonneuronal SNAREs were identified in exocrine pancreatic tissue and could therefore mediate zymogene granule secretion. SNAP 23 was identified as a central SNARE in Kupffer cells, the resident macrophages of the liver. As a central aspect of this work, these nonneuronal SNAREs were for the first time characterized in neuroendocrine cells along the gastrointestinal mucosa and in neuroendocrine tumors. Their neuroendocrine origin was confirmed by double staining experiments and quantitative analysis. Their subcellular localization was localized in neuroendocrine BON cells, where a strong association of the SNAREs with SLMVs (synaptic like microvesicles) and LDCVs (large dense core vesicles) could be found. Further, their presence was described in mucosa-associated immune cells like mast cells, plasma cells and leucocytes in situ. Syntaxin 3, SNAP 23 and cellubrevin were present in all investigated gastrointestinal cell lines of neuroendocrine and nonneuroendocrine differentiation. This gives clear evidence, that SNARE proteins are conserved during malignant transfomation of these cells. These results indicate that the SNAREs syntaxin 3, SNAP 23 and cellubrevin are abundantly expressed in human gastrointestinal mucosa, pancreas and liver. They may be involved in mediating central steps of endocrine and exocrine secretion. Furthermore they were identified as the first nonneuronal SNAREs originally found in SLMV and LDCV of neuroendocrine cells.