Mechanismen reduzierter Ansprechbarkeit auf Opioid-Analgetika bei diabetischer Neuropathie

Abstract

Im Rahmen einer diabetischen Neuropathie kommt es zum Verlust der analgetischen Wirksamkeit von Opioid-Analgetika. Unklar sind bisher die genauen zugrunde liegenden Mechanismen. In der aktuellen Literatur ist unter anderem ein vermehrter lysosomaler Abbau von µ-Opioidrezeptoren (MOR) bei der späten diabetischen Neuropathie beschrieben. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Mechanismen der reduzierten Ansprechbarkeit von Opioiden in der Frühphase der diabetischen Neuropathie, 4 Wochen nach Diabetes-Induktion, und untersucht eine mögliche Interventionsmöglichkeit mit Aminoguanidin als Synthese-Hemmer der advanced glycation end products (AGE). Ein experimenteller Diabetes mellitus wurde durch die i.v.-Applikation von 45 mg/kg KG Streptozotocin in männlichen Wistar-Ratten erzeugt. Nach 4 Wochen wurden Verhaltensversuche zur Messung der Sensitivität auf mechanische Druckreize vor und nach Applikation des µ-Agonisten Fentanyl durchgeführt. Zusätzlich wurden immunhistochemische Analysen von Neuronen der spinalen Hinterwurzelganglien mittels spezifischer Antikörper gegen den phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Zustand von µ-Opioid-Rezeptoren durchgeführt, sowie Untersuchungen der Expression einzelner Isoformen der Proteinkinase C (PKC) in Western Blot-Analysen und real time Polymerase- Kettenreaktion (PCR). Des Weiteren wurde der Einfluss einer gleichzeitigen Aminoguanidin-Behandlung diabetischer Tiere untersucht. Ergebnisse: Die wesentlichen Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen den Verlust der analgetischen Wirksamkeit des µ-Agonisten Fentanyl in der Frühphase (nach 4 Wochen) eines Streptozotozin (STZ)-induzierten Diabetes mellitus. In dieser Phase gibt es keine quantitative Veränderung in der Anzahl an MOR auf peripher sensorischen Neuronen. Jedoch zeigt sich eine signifikante Zunahme im Ausmaß der Phosphorylierung und damit der Desensitivierung dieser MOR. Infolgedessen kommt es zu einer signifikant reduzierten G-Protein-Kopplung. Als mögliche Ursache der vermehrten MOR-Phosphorylierung zeigte sich eine erhöhte PKC- Expression und -Aktivität peripher sensorischer Neurone. Die Inhibition der PKC-Aktivität führte zu einer Verhinderung der MOR-Phosphorylierung mit konsekutiv gesteigerter G-Protein-Bindung am MOR sowie einer gesteigerten Ansprechbarkeit auf den µ-Agonisten Fentanyl in Verhaltensversuchen. Eine mögliche Ursache für die Diabetes-induzierte, vermehrte PKC-Expression und -Aktivität könnte der vermehrte Anfall an AGE sein. Tatsächlich zeigten erste Ergebnisse, dass mit einer Aminoguanidinbehandlung, die bekanntermaßen die Bildung von AGE verhindert, die PKC-Aktivierung sowie letztendlich die MOR- Phosphorylierung aufgehoben werden konnte. Schlussfolgerung: Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die verringerte Ansprechbarkeit auf Opioid-Analgetika in der Frühphase der diabetischen Neuropathie vor allem durch eine vermehrte Anzahl phosphorylierter und daher desensitivierter MOR bedingt ist. Die erhöhte Expression der PKC-Isoformen als wahrscheinliche Ursache der MOR- Phosphorylierung, sowie deren Reversibilität mit konsekutiver Verbesserung der Opioidansprechbarkeit durch die gleichzeitige Behandlung mit Aminoguanidin unterstreichen die These, dass eine mögliche Hauptursache in der vermehrten Akkumulation von AGE zu suchen ist.

Diabetic neuropathy commonly leads to a loss in analgesic efficacy of opioids. The mechanisms behind this phenomenon are still unclear. In the current literature on late-stage diabetic neuropathy an increased lysosomal degradation of µ-opioid receptors is described as a possible cause. This project investigates the mechanisms behind the reduced responsiveness of opioids during the early phase of diabetic neuropathy, e.g. at four weeks after induction of diabetes. Additionally, it examines a possible intervention consisting of aminoguanidine as a synthesis inhibitor of advanced glycation end products. Diabetes mellitus was induced in male Wistar rats through the intravenous application of 45 mg/kg BW streptozotocin destroying pancreatic ß-cells. After four weeks, behavioral experiments were carried out to measure sensitivity towards mechanical stimuli before and after application of the µ-agonist fentanyl. Additionally, immunohistochemical analyses of neurons in spinal dorsal root ganglions were conducted by employing specific antibodies targeted at both the phosphorylated and non-phosphorylated forms of µ-opioid receptors. In addition, the expression of individual isoforms of protein kinase C were studied by Western Blot and real time PCR. Furthermore, the influence of a concurrent aminoguanidine treatment on diabetes-induced alterations of the opioid system was investigated. The main results of this doctoral thesis reveal the impaired analgesic efficacy of µ-agonists, such as fentanyl, during the early phase (after four weeks) of STZ-induced Diabetes mellitus. During this phase, there are no quantitative changes in the number of µ-opioid receptors (MOR) on peripheral sensory neurons. However, a significant increase in MOR phosphorylation became apparent, leading to a desensitization of these MOR. As a result, there is a substantial reduction in G protein coupling. A possible cause of the observed increase in MOR phosphorylation may be the elevated expression and activity of protein kinase C (PKC) in peripheral sensory neurons. The inhibition of PKC activity led to a hindering of MOR phosphorylation alongside a consecutive increase in G protein coupling, as well as an increased responsiveness to µ-agonists, such as fentanyl, during behavioral experiments. A possible explanation for the diabetes-induced increase in PKC expression and activity may be the augmented amount of advanced glycation end products (AGE). Indeed, preliminary results indicated that an aminoguanidine treatment - already known to hinder the production of AGE - could reverse PKC activity as well as MOR phosphorylation. These results suggest that the reduced responsiveness to opioid analgesics in the early phases of diabetic neuropathy is caused by an increased number of phosphorylated and, thus, desensitized MOR. The increased expression of PKC isoforms as a probable cause of enhanced MOR phosphorylation as well as its reversibility alongside subsequent improvement in opioid responsiveness through a simultaneous aminoguanidine treatment underlines the hypothesis the increased accumulation of AGE may be a possible leading cause of this phenomenon.