Untersuchungen zur subzellulären Verteilung von Proteinkinase C

Abstract

Proteinkinase C (PKC) ist eine Gruppe von Serin/Threonin Kinasen mit wichtigen Funktionen in vielen Signaltransduktionsprozessen. Eine besondere Rolle bei der Wahrnehmung der spezifischen Funktionen der PKC Isoformen nimmt die subzelluläre Veteilung ein, die sich häufig nach PKC-Aktivierung verändert. Zur Untersuchung der subzellulären Verteilung von PKCa unter besonderer Berücksichtigung der Kerntranslokation verwendete ich Fusionsproteine bestehend aus PKCa und dem green fluorescent protein (GFP). Im Rahmen der Arbeit wurden zunächst neben PKCa Fusionsproteine aus Gluthathion-S-Transferase und PKCa (GST-His6-PKCa) sowie GFP und PKCa (GFP- PKCa) in Sf9-Insektenzellen hergestellt. Mit Hilfe eines Aktivitätstests wurde anschließend gezeigt, daß es sich dabei um katalytisch aktive Proteine handelt. Das Anfügen von GST-His6 und GFP an PKCa hat offensichtlich keinen Einfluß auf die Aktivität, da sich die Fusionsproteine in ihrer Aktivität nicht von PKCa unterscheiden. Gereinigtes GFP-PKCa aus den Insektenzellen transloziert wie endogene PKCa in Digitonin-permeabilisierten NIH 3T3-Fibroblasten in den Zellkern. Die Translokation beruht nicht auf simpler Diffusion, verläuft jedoch anscheinend ohne Cofaktoren . Da man bei Präinkubation mit dem Cytosolersatz Retikulozytenlysat eine Abschwächung des Kerntransports beobachtet, gibt es im Retikulozytenlysat wahrscheinlich einen Retentionsfaktor, der GFP-PKCa im Cytoplasma festhält. Permeabilisierung scheint ein generell es Signal für PKCa-Kerntransport zu sein, da GFP-PKCa auch in transfizierten permeabilisierten Zellen einer Kerntranslokation unterliegt. Die Expression von PKCa und den Fusionsproteinen GFP-PKCa und PKCa-GFP in transfizierten NIH 3T3-Fibroblasten bewirkt überraschenderweise eine Veränderung der Lokalisation verglichen mit endogener PKC a. Während endogene PKCa nach PMA-Aktivierung in den Zellkern transloziert, findet man überexprimierte aktivierte PKCa sowie GFP-PKCa und PKCa-GFP hauptsächlich an der Plasmamembran. Die Verschiebung zur Plasmamembran ist wahrscheinlich auf die Überexpression, nicht jedoch auf die Fusion von GFP an PKCa zurückzuführen. Untersuchungen mit GFP-PKCa-Deletionsmutanten deuten auf eine aktive Beteiligung der ersten 187 Aminosäuren an der Kerntranslokation von PKCa hin. Die katalytische Domäne scheint dagegen keine direkte Rolle beim Kerntransport zu spielen. Der Abschnitt zwischen den Aminosäuren 252 und 289 und die V5-Region am C-Terminus haben vermutlich eine negative regulatorische Funktion beim Kerntransport von PKCa.

Protein kinase C (PKC) is a family of serin/threonine kinases with important roles in many signal transduction processes. One important factor for the determination of the specific functions of protein kinase C´s isoforms is their specific subcellullar localisation, which changes following activation in the course of signal transduction events. In order to investigate PKCa´s subcellular distribution and especially its accumulation in the cell nucleus I used fusion proteins constisting of PKC and the green fluorescent protein (GFP). In a first approach I expressed PKCa and fusion proteins constisting of glutathione-S-transferase and PKCa (GST-His6-PKCa) and GFP-PKCa in Sf9-insect cells. Using an activity assay, I could show that the proteins were catalytically active. Obviously, the N-terminal fusions GST-His6 and GFP do not influence the PKC-activity, since there is no signifikant difference between the activities of the fusion proteins and PKCa. The purified GFP-PKCa was used in an assay with digitonin-permeabilised NIH 3T3 fibroblasts. The fusion protein undergoes nuclear accumulation without any further stimuli in a manner which is not simply due to diffusion. The strong inhibition of GFP-PKCa´s nuclear import following preincubation with reticulozyte lysate suggests the existence of a binding factor interfering with nuclear accumulation. Interestingly, permeabilisation appears to be a trigger for PKCa´s nuclear translocation, since the fusion protein accumulates in the nucleus in transiently transfected cells following permeabilisation, too. Unexpectedly, transient overexpression of GFP-PKCa, PKCa-GFP and PKCa in fibroblasts favours translocation to the plasma membrane, whereas in nontransfected cells endogenous PKCa is translocated to the nucleus following activation with phorbol ester. This increased translocation to the plasma membrane seems to be favoured rather by overexpression than by GFP-fusion. Use of GFP-PKCa deletion mutants suggests that PKCa´s first 187 amino acids play an important role in the protein´s nuclear import. In contrast to this, the catalytic domain is apparantly not involved in nuclear translocation. Conceivably, sequences between 252 and 289 and the V5-region inhibit PKCa´s nuclear accumulation.