Funktionelle Charakterisierung der Kationenkanäle TRPM3 und Melastatin (TRPM1)

Abstract

Transient Receptor Potential (TRP) -Kanäle bilden eine große Familie von Kationenkanalproteinen, die durch unterschiedliche Mechanismen aktiviert und reguliert werden. Die Klassifikation der bislang identifizierten 28 humanen TRP-Proteine erfolgt in sechs TRP-Unterfamilien. Bei einigen Mitgliedern der TRPM-Kanal-Unterfamilie ist wenig über die physiologischen Rollen und zellulären Funktionen bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die beiden eng verwandten konstitutiv aktiven, Ca2+-permeablen, nicht-selektiven Kationenkanäle TRPM1 (Melastatin) und TRPM3 funktionell charakterisiert. Dabei konnte erstmals gezeigt werden, dass TRPM1 in murinen pankreatischen Β-Zellen exprimiert wird. Eine Expression des Kanal-bildenden TRPM1-Proteins konnte zusätzlich in verschiedenen Melanin-produzierenden und Melanin-defizienten Melanozyten-Zelllininien detektiert werden. Ein diskutierter Zusammenhang zwischen der Regulation der Melaninsynthese und der Expression von TRPM1 war in dieser Arbeit nicht erkennbar. Zudem konnte die Expression des TRPM2-Proteins in Melanozyten nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu TRPM1 scheint die Regulation von TRPM2 mit der Regulation der Melaninsynthese gekoppelt zu sein, da sich die Melaninproduktion reziprok zu der Proteinexpression von TRPM2 verhält. Bei der Analyse der von Lexicon Pharmaceutical Incorporated generierten TRPM3-Knockout-Mauslinie fiel auf, dass die Knockout-Strategie zu der Translation eines Proteins mit einer In- Frame-Deletion führt. Dieses Protein war mit unserem anti-TRPM3-Antikörper in Organextrakten von TRPM3-/--Mäusen detektierbar. Durch die funktionelle Charakterisierung der TRPM3-Deletionsmutante im heterologen Expressionssystem konnte gezeigt werden, dass das verkürzte TRPM3-Protein konstitutiv nicht aktiv und nicht durch die bekannten selektiven TRPM3-Agonisten aktivierbar war. Lokalisationsstudien bestätigten eine Lokalisation der TRPM3-Deletionsmutante in den gleichen Kompartimenten wie das TRPM3-Wildtyp- Protein. Ebenso konnte eine Homomeren- sowie Heteromerenbildung zwischen dem deletierten TRPM3- und dem TRPM3-Wildtyp-Protein bestätigt werden. In dieser Arbeit konnte mit Mefenaminsäure erstmals ein potenter TRPM3-selektiver Inhibitor aus der Substanzklasse der Fenamate, die als nicht-steroidale, anti- inflammatorische Wirkstoffe (NSAIDs) in der Schmerztherapie Anwendung finden, identifiziert werden. Weitere hier getestete Fenamat-Derivate konnten als Breitband-TRP-Kanalblocker klassifiziert werden. Die Substanzklasse der Fenamate bildet daher eine interessante Gruppe von kleinen Molekülen, die als pharmakologische Werkzeuge zur Charakterisierung und Regulation von TRP- Kanälen herangezogen werden können. Unsere Untersuchungen lieferten zudem Hinweise darauf, dass TRPM3 eine signifikante Rolle bei der Regulation der Insulinsekretion spielt. Die spezifische Aktivierung von TRPM3 in Insulin- sezernierenden INS-1E Zellen und murinen pankreatischen Β-Zellen führt zum Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration und zu einer Potenzierung der Insulinsekretion, wohingegen die spezifische Inhibition von TRPM3 durch den, in dieser Arbeit identifizierten, selektiven TRPM3-Inhibitor Mefenaminsäure nahezu keinen Einfluss auf die Glukose-induzierte Insulinsekretion ausübte.

Transient receptor potential (TRP) channels form a large family of cation channel proteins that are activated and regulated by different mechanisms. So far 28 human TRP proteins were identified and classified into six TRP subfamilies of which the transient receptor potential melastatin-like (TRPM) subfamily constitutes one of them. The physiological role and cellular function of some members of the TRPM channel subfamily are poorly understood. In the present work, the two closely related constitutively active, Ca2+-permeable non-selective cation channels TRPM1 (Melastatin) and TRPM3 were functional characterized. For the first time it was shown that TRPM1 is expressed in murine pancreatic Β-cells. Expression of the channel forming TRPM1 protein could also be detected in various melanin-producing and melanin- deficient melanocytes. A discussed relationship between the regulation of melanin synthesis and expression of TRPM1 was not evident in this work. In addition, the expression of TRPM2 protein could be detected in melanocytes. In contrast to TRPM1, the regulation of TRPM2 appears to be coupled with the regulation of melanin synthesis as the melanin production behaves reciprocal to the protein expression of TRPM2. The characterization of the TRPM3 knockout mouse line generated by Lexicon Pharmaceuticals Incorporated shows that the choosen inactivation strategy results in the translation of a TRPM3 protein with an in frame deletion of 89 AA. The protein was detectable with our anti- TRPM3 antibody in extracts of TRPM3 mice. Functional characterization of the TRPM3 deletion mutant in the heterologous expression system demonstrated that the channel showed neither a constitutive activity nor could be activated by the known selective agonists of TRPM3. Localization studies confirmed a localization of TRPM3-deletion mutant in the same cellular compartments as the wild-type TRPM3 protein. Also, the formation of homomers and heteromers between the truncated TRPM3 and the TRPM3 wild-type protein could be confirmed. We identified mefenamic acid as potent selective inhibitor of TRPM3 within the class of fenamates, which are clinically used as non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in pain treatment. The results presented here demonstrate that mefenamic acid blocks TRPM3 from the outside and that the potency of its inhibitory effect depends on the extracellular pH. All other tested fenamat-derivatives could be classified as broad-range TRP-channel blockers. Thus, the class of fenamates represents an interesting group of small molecules that can be used as pharmacological tools for the characterization and modulation of TRP channels. Our studies also provided evidence that TRPM3 plays a significant role in the regulation of insulin secretion. The specific activation of TRPM3 in insulin-secreting INS-1E cells and murine pancreatic Β-cells leads to an increase of cytosolic calcium concentration and to a potentiation of insulin secretion, which could be blocked by mefenamic acid, the inhibitor characterized in this study.