Autoaggressive und regulatorische T-Zellen beim Systemischen Lupus Erythematodes: ein dynamisches Gleichgewicht

Abstract

Obgleich der Systemische Lupus Erythematodes (SLE) gewissermaßen als Prototyp der systemischen Autoimmunerkrankungen gilt, ist seine Pathogenese noch weitgehend unklar. Von Bedeutung scheint im Rahmen des Auftretens von Autoantikörpern gegen dsDNA auch eine mangelnde Kontrolle autoreaktiver CD4+ T -Helfer-Zellen zu sein. Diese vor allem gegen nukleäre Peptidantigene gerichteten T-Helfer-Zellen können in einer immunologischen Kreuzreaktion die Produktion von Anti-dsDNA-Antikörpern induzieren. Die Untersuchung autoreaktiver T-Helfer-Zellen gestaltete sich in der Vergangenheit jedoch methodisch schwierig. Hauptgrund hierfür ist ihre sehr geringe Frequenz im periphervenösen Blut. Dies machte lange Stimulationszeiten von mehreren Tagen erforderlich, um die T-Helfer-Zellen anhand ihrer gesteigerten Proliferation identifizieren zu können. Mit steigender Stimulationsdauer ergab sich allerdings die Schwierigkeit, eine ausreichende Spezifität der Messungen sicherzustellen. Durch Zelluntergang eingetragene nukleäre Antigene (endogene Kontamination) und der Einfluss von außen eingetragener Verunreinigungen (exogene Kontamination) brachten die vorhandenen Methoden an die Grenze ihrer spezifischen Aussagekraft. In dieser Arbeit wird eine leicht zu handhabende zytometrische Nachweismethode autoreaktiver T-Helfer-Zellen im periphervenösen Blut von SLE-Patienten vorgestellt. Als Marker für die antigenspezifische Aktivierung wurde CD40L verwandt. Die Stimulationszeit konnte mit 6 Stunden wesentlich kürzer gewählt werden als bei den bisherigen Proliferationsassays. Dies garantiert eine Messung der präformierten autoaggressiven Immunantwort und umgeht den Spezifitätsverlust durch eine mehrtägige Stimulation. Die Methode erlaubt im selben Arbeitsgang eine genaue zytometrische Phänotypisierung der autoaggressiven Zellen, die zudem einer gezielten Anreicherung und Kultivierung mittels MACS zur Verfügung stehen. Mittels der CD40L-Expression wurde die autoaggressive T-Helfer-Zell-Antwort in einem repräsentativen SLE-Kollektiv (n= 41 Blutproben) untersucht. Gegen Nukleosomen gerichtete T-Helfer-Zellen konnten bei 6/19 (31,6%) der untersuchten Proben festgestellt werden. Autoreaktive T-Helfer-Zellen gegen das nukleäre Peptidantigen SmD1(83-119) ließen sich demgegenüber wesentlich seltener nachweisen 2/41 (4,9%). Weiterhin wurde der Einfluss der regulatorischen T-Zellen auf die autoaggressive Immunantwort bei 11 Proben mittels einer in vitro-CD25-Depletion untersucht. Durch die Depletion der Treg-Zellen konnte eine Steigerung der T-Helfer-Zell-Antwort gegen das SmD1(83-119) Peptid um 46,6% erreicht werden (p=0,05), die sich damit signifikant vom Kontrollniveau abhebt (p=0,026). Diese demaskierte SmD1(83-119)-Antwort zeigt zudem eine exzellente Korrelation mit der Krankheitsaktivität gemessen im SLEDAI-Score (p=0,005; r=0,779) und ist in dieser Untersuchung der beste Krankheitsaktivitätsmarker. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung des dynamischen Gleichgewichtes autoreaktiver und regulatorischer T-Zellen für die Pathogenese des SLE. Wird die im Rahmen eines Krankheitsschubs verstärkte autoreaktive Immunantwort nicht effektiv durch die regulativen T-Zellen beherrscht, kommt es zur autoreaktiven Selbstschädigung. Die entscheidende Rolle der regulatorischen T-Zellen für die Krankheitsdynamik im humanen SLE konnte hier erstmals in dieser Form gezeigt werden. Regulative T-Zellen und das Autoantigen SmD1(83-119)-Peptid stellen vielversprechende Ansatzpunkte für zukünftige spezifische Immuntherapien dar. Die hier etablierte Methode zur zytometrischen Messung autoreaktiver T-Helfer-Zellen im Patientenblut könnte auch in anderen Autoimmunerkrankungen einen direkten Zugang zur autoaggressiven T-Zell-Antwort ermöglichen.

Although systemic lupus erythematosus (SLE) is considered to be a prototype of a systemic autoimmune disease, its pathogenesis still remains largely unclear. However, an impaired control of autoreactive CD4+ T helper cells seems to be important for the tolerance break down as autoreactive T helper cells specific for nuclear peptide antigens have been shown to induce the production of anti- dsDNA antibodies. The detection of these autoreactive T helper cells is limited by their very low frequency in the peripheral venous blood, though. Accordingly, several days of antigenic stimulation have been required to efficiently identify T helper cells due to their increased proliferation. Since long term stimulations are prone to unspecific effects caused by exogenous culture contamination and endogenous contamination with nuclear autoantigens liberated in the course of naturally occurring cell death the significance of these measurements was limited. In this work, a recently established method of measuring T cell activation by flow cytometry is advanced for the detection of autoreactive T helper cells in the peripheral venous blood of SLE patients. As a marker of antigen-specific activation CD40L (CD154) was used. The considerably shorter stimulation time of six hours guarantees a detection of the preformed autoaggressive immune response and avoids the loss of specificity of a long term stimulation. At the same time, this method enables an exact cytometric phenotyping of the autoaggressive cells, which are further accessible to their enrichment by MACS. The autoaggressive T helper cell response was determined according to the intracellular expression of CD40L in CD4+ T helper cells after stimulation with SLE-associated autoantigens in a representative SLE collective (n = 41 blood samples). While a autoreactive response to human nucleosomes could be observed in 6 of 19 (31.6%) samples, autoreactive T helper cells specific for the SmD1(83-119) peptide were detectable only in 2 of 41 (4.9%) samples. To determine the influence of regulatory T cells (Tregs) on the activation of autoaggressive T helper cells, Tregs were removed by depleting CD25+ cells prior to antigenic stimulation in 11 samples. Due to the removal of Tregs a significant increase of the SmD1(83-119)-specific T helper cell response could be achieved (+46.6%, p=0.05). This unmasked SmD1(83-119)-response laid significantly above the level of the unstimulated controls (p = 0.026). Furthermore, it strongly correlated with the disease activity as assessed by the SLEDAI score (p=0.005, r=0.779). The results of this study emphasize the importance of a dynamic balance of autoreactive and regulatory T cells in the pathogenesis of SLE. Thus, an ineffective control of the autoreactive immune response by Tregs can lead to autoreactive self-defeating. Regulatory T cells and the autoantigen SmD1(83-119) peptide provide promising starting points for future specific immunotherapies. The direct assessment of autoantigen-specific CD4+ T helper cells according to the antigen-induced CD154 expression in combination with a depletion of CD25+ Tregs may be of further use in other autoimmune diseases.