Phänotyp-Charakterisierung reaktiver T-Zellen von Melanompatienten gegen autologe Tumorzellen und ein neues Tyrosinase-Epitop

Abstract

Zahlreiche Untersuchungen belegen inzwischen die Existenz TAA-spezifischer T-Zellen bei unterschiedlichen Tumorentitäten. Besonders das maligne Melanom ist für seine Antigenität bekannt und wurde von Tumorimmunologen in den vergangenen Jahren intensiv erforscht. Viele Studien konnten Tumor-reaktive T-Lymphozyten nach in vitro Expansion von Vorläuferzellen aus dem peripheren Blut von Melanompatienten nachweisen. Die in vitro Expansion führt jedoch zu qualitativen und quantitativen Veränderungen der T-Zellen, so dass die in vivo-Funktion der Tumor-gerichteten Immun-Antwort nur eingeschränkt beurteilt werden kann. In dieser Arbeit wurde ein methodischer Ansatz gewählt, der direkt ex vivo zirkulierende T-Lymphozyten, die spezifisch autologe Tumorzellen erkennen, quantifiziert und charakterisiert. Diese Untersuchung erforderte eine sehr sensitive Nachweismethode, die reaktive Zellen auf Einzelzellniveau nachweist. Da zusätzlich auch der Phänotyp der reaktiven Zellen beurteilt werden sollte, wurden zunächst zwei durchflußzytometrische Methoden im Vergleich mit dem IFNg-ELISPOT-Assay, einer bereits etablierten, sensitiven Methode zur T-Zell-Analyse evaluiert. Die Analyse von Frequenzen Influenza-reaktiver T-Zellen ergab übereinstimmende Ergebnisse mit der IZ-DZ und dem IFNg-ELISPOT-Assays. Deshalb wurde nachfolgend die IZ-DZ zur Quantifizierung der Tumor-reaktiven T-Zellen bei Melanompatienten eingesetzt. Bei allen sechs untersuchten Patienten konnten Melanom-reaktive T-Zellen in der CD8+- bzw. in der CD4+-Population nachgewiesen werden. Die Frequenzen lagen mit 0,13%-2,17% spezifischer CD8+ T-Zellen in der Größenordnung Virus- reaktiver T-Zellen. Die Phänotyp-analysen ergaben, dass es sich bei den reaktiven Zellen vor allem um CD45RA+CCR7- Effektorzellen handelte. Die Koexpression von Granzym B in den Tumor-reaktiven Zellen weist außerdem darauf hin, dass diese Zellen in vivo möglicherweise direkte zytotoxische Funktionen ausüben. Bei einer Patientin gelang nach direkter Separation Tyrosinase- spezifischer CD45RA+CCR7- T-Zellen aus dem peripheren Blut mittels Tetrameren der Nachweis der Zytotoxizität direkt ex vivo. Außerdem wurde die IZ-DZ in dieser Arbeit zur weitergehenden Charakterisierung Tyrosinase-reaktiver T-Zellen eingesetzt, die gegen ein neues, durch computergestützte Epitop- Vorhersage ermitteltes HLA-A1-restringiertes Tyrosinase-Peptid gerichtet sind. Mit dem ELISPOT-Assay wurden reaktive T-Zellen gegen das neue Tyrosinase- Epitop Tyr454-463 nachgewiesen, die durchflußzytometrisch mit der IZ-DZ näher phänotypisiert wurden: Es handelt sich bei den reaktiven Zellen um CD3+CD8+ T-Lymphozyten, deren Effektorpotential durch den Nachweis von Granzym B gezeigt wurde. Insgesamt demonstrieren die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse, dass Melanompatienten häufig funktionelle T-Zellantworten gegen den Tumor aufbauen. Die Beurteilung des Phänotyps reaktiver T-Zellen erlaubt ihre Zuordnung zu Differenzierungs-Subtypen, den naiven T-Zellen, Gedächtnis- und Effektorzellen. Die bei unseren Patienten nachgewiesenen Melanom-reaktiven Lymphozyten bilden eine Mischpopulation aus überwiegend Effektorzellen, aber auch Gedächtniszellen. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass Tumor-reaktive T-Zellen prinzipiell sowohl in der Lage sind, Tumorzellen zu zerstören, als auch eine langanhaltende Immunität aufrechtzuerhalten.

There is evidence that tumor patients can spontaneously raise T cell responses against tumor antigens. Investigating the functional state of tumor-reactive T cells in patients is of high significance for understanding the role of these cells in tumor immuno-surveillance. Therefore quantification and phenotype- characterization of melanoma-reactive T cells in patients with advanced melanoma was performed. First a flow cytometric approach was established to allow multi-parameter analysis the phenotypic and functional properties of tumor-reactive T cells directly ex vivo. To analyze the suitability of T cell enumeration by flow cytometry a comparison with the IFN-gamma ELISPOT assay was performed. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from six healthy subjects were analyzed for the frequency of influenza reactive CD8+ T cells by flow cytometry detecting either intracellular IFN-gamma (IC-FC) or secreted IFN-gamma (S-FC). All samples were also analyzed by IFN-gamma ELISPOT assay. This comparison showed the suitability for the quantification of antigen reactive T cells in PBMC by IC-FC directly ex vivo. Because of the advantage of IC-FC to enumerate and simultaneously determine the phenotype of antigen- reactive T cells the IC-FC was used to characterize T cells in 6 melanoma- patients reactive with the autologous melanoma-cell line. 5 out of 6 patients had a T cell response ranging from 0.13% to 2.17 % melanoma-specific CD8+ T cells. Phenotypic characterization using four-color flow cytometry revealed that a significant fraction of these cells was CD45RA+CCR7-, a phenotype proposed to characterize cytolytic effector T cells. Coexpression of intracellular Granzyme B in a significant fraction of melanoma-reactive T cells was shown, demonstrating cytotoxic potential of these T cells. Consistently with their phenotypic characteristics A2/tyrosiase peptide tetramer+ CD8+ T cells, isolated by cell sorting, were directly lytic ex vivo and able to specifically recognize tyrosinase-expressing tumor cells. Furthermore the IC-FC was used to characterize the phenotype of T cells reactive with a new identified HLA-A1-binding epitope of the melanoma-antigen tyrosinase. The tyrosinase-reactive T cells were shown to have a CD3+CD8+ phenotype. Most of this T cell population also expressed granzyme B and therefore had cytotoxic potential. Altogether these results give evidence that a proportion of melanoma patients has circulating tumor-reactive T cells. Phenotype characterization revealed that a fraction of this population are effector T cells which also have cytotoxic potential.