SELEX-Technologieentwicklung im Hochdurchsatz

Abstract

Der SELEX-Prozess zur Selektion funktioneller Nukleinsäuren (hier: Aptamere) ist, obgleich mittlerweile vielfach modifiziert, noch immer ein zeit- und damit kostenintensives Verfahren. Eine parallele Selektion von DNA-Aptameren in 10 Runden gegen Streptavidin wurde halbautomatisiert, und zunächst nach herkömmlichen Protokollen (Klonierung, Sanger- Sequenzierung), durchgeführt und anschließend mithilfe einer massiv parallelen Sequenzierungstechnologie (next-generation sequencing) aller Runden eingehender analysiert. Auf drei Runden reduzierte und optimierte SELEX-Protokolle wurden für zwei weitere Streptavidin-Aptamer-Selektionen im Zuge dieser Arbeit entwickelt, die möglichen Binder über next-generation sequencing identifiziert. Angereicherte Sequenzen sind in geeigneten Bindungsstudien in der Form von vollsynthetischen Oligonukleotiden hinsichtlich ihrer Zielmolekül-Affinität charakterisiert worden. Im Hinblick auf eine mögliche kommerzielle Verwertbarkeit wurde die Affinitätschromatographie von rekombinanten Streptavidin und eines Fusionsproteins als beispielhafte Anwendung von Aptameren in der Biotechnologie gewählt. Amplifikationsreaktionen besonders hoch diverser Nukleinsäuregemische, wie sie bei SELEXExperimenten zum Einsatz kommen, bergen das Risiko der Artefaktentstehung. Die in vitro- Kompartimentierung der PCR durch Wasser-in-Öl-Emulsionen erlaubte hingegen eine nahezu klonale Amplifikation ohne Artefakte. Eine Optimierung des RNA-SELEX-Prozesses erfolgte durch die Verwendung der Qβ-Replikase zur isothermalen RNA- Amplifikation. Üblicherweise auftretende Kontaminationen wurden durch das Emulgieren (Wasser-in-Öl-Emulsionen) der Reaktionen verhindert. Hierdurch konnten die zeitaufwendigen Arbeitsschritte reverse Transkription, PCR und in vitro-Transkription eingespart werden. Der Flaschenhals von der parallelen SELEX über Einzelklonsequenzierung, Sequenzauswertung und der Bindungsstudien einzelner Klone konnte durch die Ergebnisse dieser Arbeit erfolgreich geweitet werden. Hinsichtlich der zielgerichteten Generierung von Aptameren werden nachfolgende Studien sicherlich von den gewonnenen Erkenntnissen profitieren können.

The SELEX process for the selection of functional nucleic acids (here: aptamers) is, although frequently modified, still a time and therefore cost- intensive process. A parallel and semiautomated selection of DNA aptamers in 10 rounds against Streptavidin was first conducted according to conventional protocols (cloning, Sanger sequencing), and then, using massively parallel sequencing (next-generation sequencing), all rounds were more thoroughly analysed. Once optimized and reduced to three rounds, the SELEX protocol was applied for two additional Streptavidin aptamer selections. Possible binders were identified via next-generation sequencing. Enriched sequences, in the form of fully synthetic oligonucleotides, were characterized with regard to their target molecule affinity in appropriate binding studies. Affinity chromatography of recombinant streptavidin and a fusion protein was chosen to exemplify the biotechnological application of aptamers with a view to possible commercial use. Amplification reactions of particularly highly diverse nucleic acid mixtures, as they are used in SELEX experiments, carry the risk of the generation of artifacts. However, in vitro compartmentalization of PCR by water in oil emulsions, allowed an almost clonal amplification without artifacts. An optimization of the RNA SELEX process was carried out using the Qβ Replicase for isothermal RNA amplification. Commonly occurring contaminants were avoided using water-in-oilemulsion reactions. This allowed time consuming steps like reverse transcription, PCR and in vitro transcription to be by- passed. The bottleneck of parallelized SELEX, via single clone sequencing, sequence analysis and binding studies of individual clones, could be successfully ameliorated by the results of this work. Subsequent studies regarding the targeted generation of aptamers will certainly benefit from the acquired knowledge.