Untersuchungen zur transkriptionellen und posttranskriptionellen Regulation der Rezeptor-Tyrosin-Kinase c-kit an humanen Mastzellen unterschiedlicher Reifegrade

Abstract

Die Regulation der Rezeptor-Tyrosinkinase c-kit in humanen dermalen Mastzellen war zu Beginn dieser Arbeit noch wenig erforscht. Zur Proteinebene lagen bereits einige Studien vor, die sich mit der Internalisierung, Ubiquitinierung und nachfolgender Degradierung sowie proteolytischem Shedding beschäftigten. Zur transkriptionellen Regulation waren jedoch nur wenige Daten publiziert, die sich zudem vor allem auf das murine System bezogen. Um eine mögliche Relevanz der Transkriptionsfaktoren, die im murinen System von Bedeutung sind, für dermale Mastzellen zu untersuchen, wurden die Transkriptionsfaktoren MITF, SCL und Sp1 in den drei hier eingesetzten Mastzellsystemen untersucht. Auf Proteinebene sollte in dieser Arbeit hauptsächlich dem Grundumsatz von c-kit in Mastzellen unterschiedlicher Reifestadien nachgegangen werden und untersucht werden, ob und inwieweit dieser vom Reifegrad abhängigen Unterschieden unterliegt. Dazu wurden reife Hautmastzellen zusammen mit den zwei Zelllinien HMC-1 und LAD 2 untersucht. Die hier generierten Daten weisen eine weitgehend unabhängig vom Reifegrad vorliegende, starke Anfälligkeit für Unterbrechungen der de novo- Transkription und Translation nach. Es konnte hinsichtlich der Internalisierung nach Ligandenbindung für Mastzellen unterschiedlicher Reifegrade eine rasche und starke Abnahme der Zelloberflächendichte von c-kit in allen drei Mastzellarten nachgewiesen werden. In Gelshiftassays ergab sich auf transkriptioneller Ebene für die Sonde SP1 eine Bindungsaktivität nur in proliferierenden Mastzellen, nicht jedoch in kutanen Mastzellen. Für die Sonde SCL-MITF war eine Bindungsaktivität in allen drei Mastzellsystemen nachweisbar. Im Supershiftassay mit HMC-1 Zellen konnte für diese gezeigt werden, dass offenbar MITF der bindende Faktor ist. Somit scheint dem Transkriptionsfaktor MITF auch in humanen Mastzellen eine wichtige Rolle zuzukommen. Der Transkriptionsfaktor SP1 scheint mit zunehmendem Reifestadium der Zelle an Bedeutung zu verlieren.

At the beginning of this work, little was known about how the tyosine-kinase receptor c-kit was regulated in human skin mast cells. On protein level some studies were available concerning internalization, ubiquitination and subsequent degradation as well as proteolytical shedding. On the transcriptional level only few data were known, merely concentrating on the murine system. To investigate the possible relevance of transcription factors known from the murine system in human skin mast cells, the transcription factors MITF, SCL and Sp1 were analyzed in the three mast cell subsystems, spanning different stages of maturation. On protein level, investigations on the basal cycling of the receptor should be used to highlight the possible differences in dependance on the degree of maturation of the cell. Therefor we examined mature human skin mast cells along with the mast cell lines HMC-1 and LAD2. The generated data prove a strong susceptibility for interruptions of transcription and translation, being mostly independent ot the degree of maturation of the cell. Concerning internalization after ligand binding, a fast onset of downregulation of cell surface densitiy of the receptor could be observed in the three mast cell subsets. On the transcriptional level, electrophoretic gel shift assays were used to investigate the potential role of transcription factors. It could be shown, that Sp1 is displaying a binding activity only in proliferating mast cells but coul not be observed in mature skin mast cells. For the oligonucleotide probe MITF-SCL a binding activity could be shown in all three mast cell subsets. In supershiftassays we examined the binding factor that seemed to be MITF in case of HMC-1 cells. These data indicate an outstanding role for the transcription factor MITF even in mature human mast cells, while the transcription factor Sp1 seems to become less important during the maturation process of the mast cell.